ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 ഡ്യൂപ്ലെക്സ് വെൽഡഡ് ട്യൂബ് കെമിക്കൽ ഇൻഡസ്ട്രി കെമിക്കൽ ഘടകത്തിന്, SPECC1L ന്റെ കുറവ് പിളർന്ന സന്ധികളുടെ സ്ഥിരത വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിനും തലയോട്ടിയിലെ ന്യൂറൽ ക്രസ്റ്റ് സെല്ലുകളുടെ ശോഷണം കുറയ്ക്കുന്നതിനും ഇടയാക്കുന്നു.

Nature.com സന്ദർശിച്ചതിന് നന്ദി.പരിമിതമായ CSS പിന്തുണയുള്ള ഒരു ബ്രൗസർ പതിപ്പാണ് നിങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്നത്.മികച്ച അനുഭവത്തിനായി, നിങ്ങൾ ഒരു അപ്‌ഡേറ്റ് ചെയ്‌ത ബ്രൗസർ ഉപയോഗിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു (അല്ലെങ്കിൽ Internet Explorer-ൽ അനുയോജ്യത മോഡ് പ്രവർത്തനരഹിതമാക്കുക).കൂടാതെ, നിലവിലുള്ള പിന്തുണ ഉറപ്പാക്കാൻ, ഞങ്ങൾ ശൈലികളും JavaScript ഇല്ലാതെ സൈറ്റ് കാണിക്കുന്നു.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 രാസ വ്യവസായത്തിനുള്ള ഡ്യൂപ്ലെക്സ് വെൽഡഡ് ട്യൂബ്

Liaocheng Sihe SS മെറ്റീരിയൽ കമ്പനി, ലിമിറ്റഡ്.സ്റ്റെയിൻലെസ് സ്റ്റീൽ തടസ്സമില്ലാത്ത പൈപ്പുകൾ, ബ്രൈറ്റ് അനീൽഡ് ട്യൂബുകൾ, തടസ്സമില്ലാത്ത കോയിൽഡ് ട്യൂബുകൾ തുടങ്ങിയവയിൽ വൈദഗ്ദ്ധ്യമുള്ള ഒരു പ്രമുഖ നിർമ്മാതാവാണ്.ഉപഭോക്താക്കൾക്ക് സൗകര്യമൊരുക്കുന്നതിനായി, ഞങ്ങൾ പൈപ്പുകളും ട്യൂബുകളും വെൽഡിഡ് ചെയ്തിട്ടുണ്ട്.Liaocheng Sihe SS മെറ്റീരിയൽ കമ്പനി, ലിമിറ്റഡ്.ഏറ്റവും നൂതനമായ ഉൽപ്പാദനവും പരീക്ഷണ ഉപകരണങ്ങളും ഉണ്ട്.ഞങ്ങൾക്ക് നിങ്ങളുടെ ആവശ്യം പൂർണ്ണമായും തൃപ്തിപ്പെടുത്താൻ കഴിയും.സ്റ്റാൻഡേർഡ് വളരെ കർശനമായി അനുസരിച്ച്, ഞങ്ങൾ നിർമ്മിക്കുന്ന ട്യൂബുകൾക്ക് എല്ലായ്പ്പോഴും ശരിയായ OD, WT ടോളറൻസ് ഉണ്ട്.ടോളറൻസ് നിയന്ത്രണം ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കുന്ന മാനദണ്ഡങ്ങൾക്കനുസരിച്ചാണ്.ഞങ്ങളുടെ ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ എല്ലായ്പ്പോഴും ഉപഭോക്താക്കളിൽ സംതൃപ്തമാണ്.ഞങ്ങളുടെ ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ വാങ്ങുന്ന ഉപഭോക്താക്കൾ കൂടുതൽ ലാഭം സൃഷ്ടിച്ചു.
a) OD (പുറത്തെ വ്യാസം): 3.18mm മുതൽ 101.6mm വരെ
b) WT (ഭിത്തിയുടെ കനം) : 0.5mm മുതൽ 20mm വരെ
സി) ദൈർഘ്യം: ഉപഭോക്താവിന്റെ ആവശ്യമനുസരിച്ച്
d) മാനദണ്ഡങ്ങൾ : ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 മുതലായവ
ഇ) പ്രോസസ്സ് രീതി: ERW, EFW തുടങ്ങിയവ

ഓരോ സ്ലൈഡിലും മൂന്ന് ലേഖനങ്ങൾ കാണിക്കുന്ന സ്ലൈഡറുകൾ.സ്ലൈഡുകളിലൂടെ നീങ്ങാൻ ബാക്ക്, അടുത്ത ബട്ടണുകൾ ഉപയോഗിക്കുക അല്ലെങ്കിൽ ഓരോ സ്ലൈഡിലൂടെയും നീങ്ങാൻ അവസാനത്തെ സ്ലൈഡ് കൺട്രോളർ ബട്ടണുകൾ ഉപയോഗിക്കുക.
ക്രാനിയൽ ന്യൂറൽ ക്രെസ്റ്റ് സെല്ലുകൾ (സിഎൻസിസി) ഭ്രൂണ ന്യൂറൽ ഫോൾഡുകളിൽ നിന്ന് മന്ദഗതിയിലാവുകയും മിക്ക മിഡ്‌ഫേസ് ഘടനകളും രൂപപ്പെടുന്ന തൊണ്ടയിലെ കമാനങ്ങളിലേക്ക് മാറുകയും ചെയ്യുന്നു.ഒരു സാധാരണ അപായ വൈകല്യമായ ഓറോഫേഷ്യൽ ക്ലെഫ്റ്റിന്റെ എറ്റിയോളജിയിൽ CNCC അപര്യാപ്തത ഒരു പ്രധാന പങ്ക് വഹിക്കുന്നു.വിഭിന്നവും സിൻഡ്രോമിക് പിളർപ്പും ഉള്ള രോഗികളിൽ ഹെറ്ററോസൈഗസ് SPECC1L മ്യൂട്ടേഷനുകൾ കണ്ടെത്തിയിട്ടുണ്ട്.ഇവിടെ, കൾച്ചർഡ് SPECC1L നോക്ക്ഡൗൺ സെല്ലുകളിലെ കാനോനിക്കൽ അഡ്‌ഷീവ് ജംഗ്ഷൻ (എജെ) ഘടകങ്ങളുടെ മെച്ചപ്പെടുത്തിയ സ്റ്റെയിനിംഗ്, β-കാറ്റനിൻ, ഇ-കാതറിൻ എന്നിവ ഞങ്ങൾ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുന്നു, കൂടാതെ ഇലക്ട്രോൺ മൈക്രോഗ്രാഫുകൾ എജെയുടെ അഗ്ര-ബേസൽ ഡിഫ്യൂഷൻ കാണിക്കുന്നു.ക്രാനിയോഫേഷ്യൽ മോർഫോജെനിസിസിൽ SPECC1L ന്റെ പങ്ക് മനസിലാക്കാൻ, ഞങ്ങൾ ഒരു Specc1l കുറവുള്ള മൗസ് മോഡൽ സൃഷ്ടിച്ചു.ഹോമോസൈഗസ് മ്യൂട്ടന്റുകൾ ഭ്രൂണ മാരകമാണ്, കൂടാതെ ന്യൂറൽ ട്യൂബ് ക്ലോഷറും CNCC ലാമിനേഷനും പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു.മ്യൂട്ടന്റ് ന്യൂറൽ ഫോൾഡുകളിൽ എജെ പ്രോട്ടീൻ സ്റ്റെയിനിംഗ് വർദ്ധിക്കുന്നു.ഈ AJ വൈകല്യം CNCC ഡീലാമിനേഷനിലെ ഒരു വൈകല്യവുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു, AJ പിരിച്ചുവിടൽ ആവശ്യമാണ്.കൂടാതെ, Specc11 മ്യൂട്ടന്റ്‌സ് PI3K-AKT സിഗ്നലിംഗ് കുറയ്ക്കുകയും അപ്പോപ്റ്റോസിസ് വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും ചെയ്തു.വിട്രോയിൽ, വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് സെല്ലുകളിൽ PI3K-AKT സിഗ്നലിംഗിന്റെ നേരിയ തടസ്സം AJ മാറ്റങ്ങൾ പ്രേരിപ്പിക്കാൻ പര്യാപ്തമാണ്.പ്രധാനമായും, PI3K-AKT പാത്ത്‌വേ സജീവമാക്കുന്നതിലൂടെ SPECC1L നോക്ക്ഡൗൺ വഴിയുള്ള AJ മാറ്റങ്ങൾ പഴയപടിയാക്കാനാകും.PI3K-AKT സിഗ്നലിങ്ങിന്റെയും AJ ബയോളജിയുടെയും ഒരു നോവൽ റെഗുലേറ്റർ എന്ന നിലയിൽ SPECC1L, ന്യൂറൽ ട്യൂബ് ക്ലോഷറിനും CNCC സ്‌ട്രാറ്റിഫിക്കേഷനും ആവശ്യമാണെന്ന് ഈ ഡാറ്റ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
ക്രാനിയൽ ന്യൂറൽ ക്രെസ്റ്റ് സെല്ലുകൾ (CNCCs) ഡോർസൽ ന്യൂറോ എക്ടോഡെമിലേക്ക് പ്രാദേശികവൽക്കരിക്കുകയും എപ്പിത്തീലിയൽ-മെസെൻചൈമൽ ട്രാൻസിഷൻ (EMT) 1,2,3 ഉൾപ്പെടുന്ന ഒരു പ്രക്രിയയിലൂടെ വികസിക്കുന്ന ന്യൂറൽ ഫോൾഡുകളുടെ ന്യൂറോപിത്തീലിയത്തിൽ നിന്ന് വേർപെടുത്തുകയും ചെയ്യുന്നു.പ്രിമിഗ്രേറ്റിംഗ് എപിത്തീലിയൽ സിഎൻസിസികൾ ഇന്റർസെല്ലുലാർ ജംഗ്ഷനുകളെ തടസ്സപ്പെടുത്തുകയും മൈഗ്രേറ്റിംഗ് മെസെൻചൈമൽ സിഎൻസിസികളായിത്തീരുകയും ചെയ്യുന്നു, ഇത് ആദ്യത്തെയും രണ്ടാമത്തെയും തൊണ്ടയിലെ കമാനങ്ങൾ നിറയ്ക്കുകയും ക്രാനിയോഫേഷ്യൽ തരുണാസ്ഥിയുടെ ഭൂരിഭാഗവും ഉണ്ടാക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.അങ്ങനെ, CNCC ഫംഗ്‌ഷനെ നിയന്ത്രിക്കുന്ന ജീനുകൾ ഓറോഫേഷ്യൽ പിളർപ്പ് പോലുള്ള ക്രാനിയോഫേഷ്യൽ അപായ അപാകതകളുടെ എറ്റിയോളജിയിൽ പലപ്പോഴും തടസ്സപ്പെടുന്നു, ഇത് സാധാരണയായി യുഎസിൽ മാത്രം 1/800 ജനനങ്ങളെ ബാധിക്കുന്നു.ജന്മനായുള്ള വൈകല്യങ്ങളിൽ ഒന്ന്8.
എലികളിലെ ഭ്രൂണവികസനത്തിന്റെ 8.5-നും 9.5-നും ഇടയിൽ മുൻവശത്തെ ന്യൂറൽ ട്യൂബ് അടയുന്നതുമായി ബന്ധപ്പെട്ട് സിഎൻസിസിയുടെ ഡീലാമിനേഷൻ സംഭവിക്കുന്നു.Irf69,10, Ghrl310, Cfl111, Pdgfrα12 എന്നിവയുൾപ്പെടെ നിരവധി മൗസ് ഓറോഫേഷ്യൽ ക്ലെഫ്റ്റ്-അസോസിയേറ്റഡ് ജീനുകളുടെ മ്യൂട്ടന്റുകൾ ഏതെങ്കിലും തരത്തിലുള്ള ന്യൂറൽ ട്യൂബ് വൈകല്യം പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു.എന്നിരുന്നാലും, ന്യൂറൽ ട്യൂബ് ക്ലോഷറിന്റെയും സിഎൻസിസി സ്‌ട്രാറ്റിഫിക്കേഷന്റെയും പ്രക്രിയകൾ സ്വതന്ത്രമായി കണക്കാക്കാം, കാരണം സ്‌പ്ലോട്ട് മ്യൂട്ടന്റ് മൗസ് (പാക്‌സ് 3) ന്യൂറൽ ട്യൂബ് അടച്ചുപൂട്ടലിൽ തകരാറുകൾ കാണിക്കുന്നു, സിഎൻസിസി സ്‌ട്രാറ്റിഫിക്കേഷനോ മൈഗ്രേഷനോ 13,14.CNCC ഡിസെക്ഷനിലും ന്യൂറൽ ട്യൂബ് ക്ലോഷറിലും വൈകല്യങ്ങളുള്ള അധിക മൗസ് മോഡലുകൾ ഈ രണ്ട് പ്രക്രിയകളുടെയും പൊതുവായ തന്മാത്രാ അടിസ്ഥാനം നിർവചിക്കാൻ സഹായിക്കും.
ന്യൂറോപിത്തീലിയൽ സെല്ലുകളിൽ നിന്ന് CNCC യെ ഒറ്റപ്പെടുത്തുന്നതിന്, ഇ-കാദറിൻ, β-കാറ്റെനിൻ, α-ഇ-കാറ്റനിൻ, ആക്റ്റിൻ ഫിലമെന്റുകളുമായി ബന്ധപ്പെട്ട α-ആക്റ്റിനിൻ എന്നിവ അടങ്ങിയ പ്രോട്ടീൻ കോംപ്ലക്സുകൾ അടങ്ങിയ പശ ജംഗ്ഷനുകളുടെ (AJs) പിരിച്ചുവിടൽ ആവശ്യമാണ്. ഓവർ എക്സ്പ്രഷൻ പഠനങ്ങൾ ന്യൂറൽ ഫോൾഡുകളിലെ ഇ-കാദറിൻ CNCC ഡിലാമിനേഷനിൽ കുറവോ കാലതാമസമോ കാണിക്കുന്നു.നേരെമറിച്ച്, ഇ-കാദറിൻ അടിച്ചമർത്തൽ ആദ്യകാല സ്‌ട്രിഫിക്കേഷനിൽ കലാശിക്കുന്നു.CNCC സ്‌ട്രാറ്റിഫിക്കേഷന്റെ സമയത്ത് EMT-യെ മധ്യസ്ഥമാക്കുന്ന പല ഘടകങ്ങളും ട്രാൻസ്‌ക്രിപ്ഷൻ ഘടകങ്ങളാണ് (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) കൂടാതെ എക്‌സ്‌ട്രാ സെല്ലുലാർ മാട്രിക്‌സ് (ECM) റീമോഡലിംഗ് പ്രോട്ടീനുകളായ മാട്രിക്‌സ് മെറ്റലോപ്രോട്ടീനേസ് (MMPs), എന്നിരുന്നാലും CNcytoskeles ഡയറക്ട് ആണ്. ഇതുവരെ അറിഞ്ഞിട്ടില്ല.PI3K-AKT പാത്ത്‌വേ ഇ-കാദറിൻ ലെവലുകളെ എതിർക്കുന്നു, പ്രധാനമായും കാൻസർ ഗവേഷണത്തിൽ നിന്ന്.എലികളിലെ PDGFα അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള PI3K-AKT സിഗ്നലിംഗ് നഷ്ടപ്പെടുന്നത്, പിളർപ്പ്, ന്യൂറൽ ട്യൂബ് വൈകല്യങ്ങൾ ഉൾപ്പെടെയുള്ള തലയോട്ടിയിലെ അസാധാരണതകളിലേക്ക് നയിക്കുന്നതായി സമീപകാല പഠനങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്.എന്നിരുന്നാലും, PI3K-AKT പാതയും CNCC സ്‌ട്രാറ്റിഫിക്കേഷനിൽ AJ സ്ഥിരതയും തമ്മിലുള്ള ബന്ധം വ്യക്തമല്ല.
വായ മുതൽ കണ്ണ് വരെ നീണ്ടുകിടക്കുന്ന ഗുരുതരമായ പിളർപ്പുള്ള രണ്ട് ആളുകളിൽ SPECC1L ആണ് ആദ്യത്തെ മ്യൂട്ടന്റ് ജീൻ എന്ന് ഞങ്ങൾ മുമ്പ് തിരിച്ചറിഞ്ഞു, ഇത് ചരിഞ്ഞ പിളർപ്പ് (ObFC) അല്ലെങ്കിൽ Tessier IV18 cleft എന്നറിയപ്പെടുന്നു.ഓട്ടോസോമൽ ആധിപത്യമുള്ള Opitz G/BBB സിൻഡ്രോം (OMIM #145410) ഉള്ള രണ്ട് മൾട്ടിജെനറേഷൻ കുടുംബങ്ങളിൽ SPECC1L മ്യൂട്ടേഷനുകൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുണ്ട്, ഇതിൽ ബാധിതരായ വ്യക്തികൾ ഹൈപ്പർ ഡിസ്റ്റൻസും പിളർപ്പ്/അണ്ണാക്കും പ്രകടമാക്കി, ടിബി ഓവർഡിസ്റ്റൻസ് സിൻഡ്രോം ഉള്ള ഒരു കുടുംബത്തിൽ (OMIM #12045454020) .ഒപിറ്റ്സ് ജി/ബിബിബി സിൻഡ്രോമിന്റെ പകുതിയിലധികം കേസുകളും എക്സ്-ലിങ്ക്ഡ് (OMIM #300000) ആണ്, ഇത് MID1 ജീനിലെ മ്യൂട്ടേഷനുകൾ മൂലമാണ് സംഭവിക്കുന്നത്, ഇത് മൈക്രോട്യൂബുൾ-അസോസിയേറ്റഡ് സെൽ അസ്ഥികൂടത്തിന്റെ പ്രോട്ടീൻ 22 എൻകോഡ് ചെയ്യുന്നു.SPECC1L, മൈക്രോട്യൂബുലുകളുമായും ആക്റ്റിൻ സൈറ്റോസ്‌കെലെറ്റണുമായും ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന ഒരു പ്രോട്ടീൻ കൂടിയായതിനാൽ, സെൽ അഡീഷനും മൈഗ്രേഷനും സമയത്ത് ആക്‌റ്റിൻ സൈറ്റോസ്‌കെലിറ്റൺ പുനർനിർമ്മിക്കുന്നതിന് ആവശ്യമായ സിഗ്നലിംഗിന് മധ്യസ്ഥത വഹിക്കാൻ കഴിയുമെന്ന് ഞങ്ങൾ അനുമാനിക്കുന്നു.ഇൻ വിട്രോ, ഇൻ വിവോ പഠനങ്ങളിലൂടെ, PI3K-AKT സിഗ്നലിങ്ങിലൂടെ AJ സ്ഥിരതയുടെ ഒരു നോവൽ റെഗുലേറ്ററായി ഞങ്ങൾ ഇപ്പോൾ SPECC1L നെ വിവരിക്കുന്നു.സെല്ലുലാർ തലത്തിൽ, SPECC1L കുറവ് പാൻ-എകെടി പ്രോട്ടീന്റെ അളവ് കുറയുന്നതിനും AJ- യുടെ അഗ്ര-ബേസൽ ഡിസ്പർഷൻ വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിനും കാരണമായി, ഇത് AKT പാതയുടെ രാസപ്രവർത്തനം വഴി ഇല്ലാതാക്കി.വിവോയിൽ, Specc11-അപര്യാപ്തമായ ഭ്രൂണങ്ങൾ ന്യൂറൽ ട്യൂബ് അടയ്ക്കുന്നതും CNCC ഡിസെക്ഷൻ കുറയുന്നതും കാണിക്കുന്നു.അങ്ങനെ, SPECC1L ഫേഷ്യൽ മോർഫോജെനിസിസ് സമയത്ത് സാധാരണ CNCC പ്രവർത്തനത്തിന് ആവശ്യമായ ഉയർന്ന നിയന്ത്രിത സെൽ അഡീഷൻ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള സിഗ്നലിങ്ങിൽ പ്രവർത്തിക്കുന്നു.
സെല്ലുലാർ തലത്തിൽ SPECC1L-ന്റെ പങ്ക് വ്യക്തമാക്കുന്നതിന്, SPECC1L18-ൽ മുമ്പ് വിവരിച്ച സ്ഥിരതയുള്ള ഓസ്റ്റിയോസാർകോമ സെൽ ലൈൻ U2OS-ന്റെ കുറവ് ഞങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ചു.SPECC1L (kd) നോക്ക്ഡൗൺ ഉള്ള ഈ സ്ഥിരതയുള്ള U2OS സെല്ലുകൾക്ക് SPECC1L ട്രാൻസ്‌ക്രിപ്റ്റുകളുടെയും പ്രോട്ടീനുകളുടെയും അളവിൽ മിതമായ (60-70%) കുറവുണ്ടായി, ഒപ്പം ആക്റ്റിൻ സൈറ്റോസ്‌കെലിറ്റണിന്റെ മൈഗ്രേഷനിലെയും പുനഃസംഘടനയിലെയും അപാകതകളും 18. വിപരീതമായി, ഗുരുതരമായ ക്ഷണികമായ കുറവ് SPECC1L മൈറ്റോട്ടിക് വൈകല്യങ്ങളിലേക്ക് നയിക്കുന്നതായി കാണിക്കുന്നു 23 .കൂടുതൽ സ്വഭാവരൂപീകരണത്തിൽ, ഞങ്ങളുടെ സ്ഥിരതയുള്ള SPECC1L-kd സെല്ലുകൾ വളരെ ഉയർന്ന തോതിലുള്ള സംഗമസ്ഥാനത്ത് രൂപഘടനയിൽ മാറ്റം വരുത്തിയതായി ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (ചിത്രം 1).താഴ്ന്ന സംഗമസ്ഥാനത്തുള്ള വ്യക്തിഗത നിയന്ത്രണ സെല്ലുകളും kd സെല്ലുകളും സമാനമായി കാണപ്പെട്ടു (ചിത്രം 1A,D).സംയോജനത്തിന് 24 മണിക്കൂറിന് ശേഷം, നിയന്ത്രണ സെല്ലുകൾ അവയുടെ ക്യൂബോയിഡൽ ആകൃതി നിലനിർത്തി (ചിത്രം. 1B, E), SPECC1L-kd സെല്ലുകൾ നീളമേറിയതാണ് (ചിത്രം. 1C, F).കൺട്രോൾ സെല്ലുകളുടെയും കെഡി സെല്ലുകളുടെയും വിവോ ലൈവ് ഇമേജിംഗിലൂടെ സെൽ ആകൃതിയിലെ ഈ മാറ്റത്തിന്റെ വ്യാപ്തി മനസ്സിലാക്കി (സിനിമ 1).സംഗമ കോശങ്ങളിൽ SPECC1L ന്റെ പങ്ക് നിർണ്ണയിക്കാൻ, ഞങ്ങൾ ആദ്യം അതിന്റെ എക്സ്പ്രഷൻ പരിശോധിച്ചു.സംയോജനത്തിൽ SPECC1L പ്രോട്ടീൻ അളവ് വർദ്ധിച്ചതായി ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (ചിത്രം 1G), എന്നാൽ SPECC1L ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റ് ലെവലുകൾ വർദ്ധിച്ചിട്ടില്ല (ചിത്രം 1H).കൂടാതെ, സെൽ സാന്ദ്രത വർദ്ധിക്കുന്നതിനനുസരിച്ച്, SPECC1L പ്രോട്ടീൻ ഇന്റർസെല്ലുലാർ ബൗണ്ടറികളിൽ (ചിത്രം 2A-E) അടിഞ്ഞുകൂടുന്നു, മെംബ്രൻ-അസോസിയേറ്റഡ് β-കാറ്റെനിൻ (ചിത്രം 2A'-E') യുമായി ഒരു പാറ്റേൺ ഓവർലാപ്പ് ചെയ്യുന്നു.ആക്റ്റിൻ സൈറ്റോസ്‌കെലെറ്റൺ 18,23-മായി SPECC1L-ന്റെ ബന്ധം കണക്കിലെടുക്കുമ്പോൾ, SPECC1L ആക്റ്റിൻ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള പശ ജംഗ്ഷനുകളുമായി (AJ) സംവദിക്കുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ അനുമാനിക്കുന്നു.
(AF) SPECC1L knockdown (DF) സെല്ലുകൾ കൺട്രോൾ U2OS സെല്ലുകളെ (AC) അപേക്ഷിച്ച് ഉയർന്ന സംഗമസ്ഥാനത്ത് (F) നീളുന്നു.വ്യത്യസ്ത സെൽ സാന്ദ്രതകൾക്കായി ഞങ്ങൾ തിരഞ്ഞെടുത്ത ആറ് ടൈം പോയിന്റുകളിൽ മൂന്നെണ്ണം (T1, T3, T6) ഇവിടെ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.(ജി) കൺട്രോൾ സെല്ലുകളിലെ കുറഞ്ഞ അളവിലുള്ള സംഗമവുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ SPECC1L പ്രോട്ടീൻ ഉയർന്ന അളവിലുള്ള സംഗമസ്ഥാനത്ത് സ്ഥിരത കൈവരിക്കുന്നുവെന്ന് കാണിക്കുന്ന വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ട് വിശകലനം.SPECC1L-ന്റെ വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ട് പ്രതീക്ഷിക്കുന്ന 120 kDa ബാൻഡും ഉയർന്ന മോളിക്യുലാർ വെയ്‌റ്റ് ബാൻഡും കാണിക്കുന്നു, ഒരുപക്ഷേ വിവർത്തനത്തിനു ശേഷമുള്ള പരിഷ്‌ക്കരണം (*).താഴ്ന്നതും ഉയർന്നതുമായ സംഗമത്തിനായി വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ട് വിശകലനം അതേ വ്യവസ്ഥകളിൽ നടത്തി.SPECC1L താഴ്ന്നതും ഉയർന്നതുമായ സംഗമസ്ഥാനത്ത് കാണിക്കുന്ന ചിത്രങ്ങൾ അതേ ബ്ലോട്ടിൽ നിന്ന് എടുത്തതാണ്.ഇതേ ബ്ലോട്ട് നീക്കം ചെയ്യുകയും β-ആക്ടിൻ ആന്റിബോഡി ഉപയോഗിച്ച് വീണ്ടും പരിശോധിക്കുകയും ചെയ്തു.(H) ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് RT-PCR വിശകലനം SPECC1L ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റ് ലെവലിൽ കാര്യമായ മാറ്റങ്ങളൊന്നും കാണിച്ചില്ല.നാല് സ്വതന്ത്ര പരീക്ഷണങ്ങളിൽ നിന്നുള്ള SEM-കളെ പിശക് ബാറുകൾ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.
(AE) SPECC1L knockdown (kd) ഉപയോഗിച്ച് സെൽ ആകൃതി വിശകലനവും U2OS സെല്ലുകളിലെ AJ മാറ്റങ്ങളും നോർമലൈസ് ചെയ്യുന്നതിന് സെൽ സാന്ദ്രതകളുടെ ഒരു ശ്രേണിയെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന ആറ് ടൈം പോയിന്റുകൾ (T1-T6) ഞങ്ങൾ തിരഞ്ഞെടുത്തു.സിംഗിൾ സെല്ലുകൾ (T1), ചെറിയ സെൽ ക്ലസ്റ്ററുകളുടെ 50-70% സംയോജനം (T2), kd സെല്ലുകൾ പുനർരൂപകൽപ്പന ചെയ്യാതെയുള്ള ഫ്യൂഷൻ (T3), kd സെല്ലുകൾ പുനർരൂപകൽപ്പന ചെയ്യൽ (T4), 24 മണിക്കൂർ മാറ്റങ്ങൾ എന്നിവ ഈ ടൈം പോയിന്റുകളിൽ ആദ്യ അഞ്ച് ഉൾപ്പെടുന്നു.kd (T5) സെല്ലുകളുടെ പിൻഭാഗത്തെ രൂപത്തിൽ.SPECC1L പ്രോട്ടീൻ പ്രധാനമായും സൈറ്റോപ്ലാസത്തിൽ T1 (A) യിൽ ചിതറിക്കിടക്കുന്നു, എന്നാൽ അതിന്റെ ശേഖരണം തുടർന്നുള്ള സമയ പോയിന്റുകളിൽ (B-E, അമ്പടയാളങ്ങൾ) ഇന്റർസെല്ലുലാർ അതിർത്തികളിൽ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു.(FJ) AJ കോംപ്ലക്സുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ഇന്റർസെല്ലുലാർ അതിരുകളിൽ β-catenin സമാനമായ ശേഖരണം കാണിക്കുന്നു.(A'-E') SPECC1L, β-catenin എന്നിവ ഉയർന്ന സെൽ സാന്ദ്രതയിൽ (അമ്പടയാളങ്ങൾ) സെൽ ബോർഡറുകളിൽ ഓവർലാപ്പിംഗ് സ്റ്റെയിനിംഗ് കാണിക്കുന്നു.(F'-J') SPECC1L-kd സെല്ലുകളിൽ, കുറഞ്ഞ സെൽ സാന്ദ്രതയിൽ (F'-H') β-catenin സ്റ്റെയിനിംഗ് സാധാരണമായി കാണപ്പെടുന്നു, എന്നാൽ കോശത്തിന്റെ ആകൃതി മാറുമ്പോൾ (I', J'; അമ്പടയാളങ്ങൾ) വികസിക്കുന്നു, ഇത് AJ ആണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. മാറിയിട്ടുണ്ട്.ബാറുകൾ = 10 µm.
AJ-യിൽ SPECC1L കുറവിന്റെ ഫലം നിർണ്ണയിക്കാൻ ഞങ്ങൾ പിന്നീട് ശ്രമിച്ചു.കാനോനിക്കൽ ഘടകങ്ങളായ F-actin, myosin IIb, β-catenin, E-cadherin24,25,26,27 എന്നിവ ഉൾപ്പെടെ നിരവധി AJ-അനുബന്ധ മാർക്കറുകൾ ഞങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ചു.മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ SPECC1L-kd സെല്ലുകളിൽ ആക്റ്റിൻ സ്ട്രെസ് നാരുകൾ വർദ്ധിച്ചു (ചിത്രം. 3A,B) 18 .ആക്റ്റിൻ ഫിലമെന്റുകളുമായി ബന്ധപ്പെട്ട Myosin IIb വിട്രോയിലെ SPECC1L-kd സെല്ലുകളിൽ സമാനമായ വർദ്ധനവ് കാണിച്ചു (ചിത്രം. 3C,D).എജെ-അസോസിയേറ്റഡ് β-കാറ്റെനിൻ കോശ സ്തരത്തിലെ കാതറിനുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നു, നിയന്ത്രണ ക്യൂബോസൈറ്റുകളിൽ ഒരു സാധാരണ "ഹണികോമ്പ്" എക്സ്പ്രഷൻ പാറ്റേൺ കാണിക്കുന്നു (ചിത്രം. 3E,G).കൗതുകകരമെന്നു പറയട്ടെ, കൺഫോക്കൽ മൈക്രോസ്‌കോപ്പി ഉപയോഗിച്ചുള്ള ഫ്ലാറ്റ് ചിത്രങ്ങളിൽ, β-കാറ്റെനിൻ (ചിത്രം. 3E,F), ഇ-കാഥറിൻ (ചിത്രം. 3G,H) എന്നിവ സംഗമിക്കുന്ന SPECC1L-അപര്യാപ്തമായ സെല്ലുകളുടെ കോശ സ്തരത്തിൽ സ്റ്റെയിൻ ചെയ്യുന്നത് വിപുലീകൃത സ്റ്റെയിനിംഗിന്റെ പ്രധാന പാറ്റേണുകൾ കാണിച്ചു.കെഡി സെല്ലുകളിലെ എജെ-അസോസിയേറ്റഡ് β-കാറ്റെനിൻ സ്റ്റെയിനിംഗിന്റെ ഈ വികാസം ഏറ്റവും കൂടുതൽ പ്രകടമാകുന്നത് സംഗമസ്ഥാനത്താണ്, എന്നാൽ സെൽ ആകൃതിയിലെ മാറ്റങ്ങൾക്ക് മുമ്പായി കാണപ്പെട്ടു (ചിത്രം. 2F-J, F'-J').ഈ വിപുലീകൃത എജെ സ്റ്റെയിനിംഗിന്റെ ഭൗതിക സ്വഭാവം നിർണ്ണയിക്കാൻ, ട്രാൻസ്മിഷൻ ഇലക്ട്രോൺ മൈക്രോസ്കോപ്പി (TEM) വഴി SPECC1L-kd U2OS സെല്ലുകളുടെ അഗ്ര-ബേസൽ പ്രതലത്തിലെ സെൽ ബോർഡറുകൾ ഞങ്ങൾ പരിശോധിച്ചു (ചിത്രം 3I,J).AJ (അമ്പടയാളങ്ങൾ) സൂചിപ്പിക്കുന്ന പ്രത്യേക ഇലക്ട്രോൺ സാന്ദ്രമായ പ്രദേശങ്ങളുള്ള കൺട്രോൾ സെല്ലുകൾക്ക് (ചിത്രം 3I) വിപരീതമായി, kd സെല്ലുകൾ (ചിത്രം. 3J) apicobasal തലത്തിൽ എജെയെ സൂചിപ്പിക്കുന്ന ഉയർന്ന ഇലക്ട്രോൺ സാന്ദ്രതയുടെ വലിയ, തുടർച്ചയായ പ്രദേശങ്ങൾ കാണിച്ചു..കൂടാതെ, തിരശ്ചീന വിഭാഗങ്ങളിൽ, kd സെല്ലുകളിൽ വിപുലമായ സെൽ മെംബ്രൺ ഫോൾഡുകൾ ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു (ചിത്രം. S1A,B), ഇത് β-കാറ്റെനിൻ, ഇ-കാതറിൻ സ്റ്റെയിനിംഗ് ബാൻഡുകളുടെ വിപുലമായ പാറ്റേൺ വിശദീകരിക്കുന്നു (ചിത്രം. 3F,H).AJ-കളിലെ SPECC1L-ന്റെ പങ്കിനെ പിന്തുണയ്‌ക്കുന്നതിനായി, β-catenin, SPECC1L-നൊപ്പം ഒത്തുചേരുന്ന U2OS സെല്ലുകളുടെ ലൈസെറ്റുകളിൽ (ചിത്രം 3K) സഹ-പ്രതിരോധശേഷി വർദ്ധിപ്പിച്ചു.എജെ മാർക്കറുകൾക്കുള്ള വിപുലീകൃത ഇമ്മ്യൂണോസ്റ്റൈനിംഗിനൊപ്പം, SPECC1L കുറവ് AJ അഗ്ര-ബേസൽ സാന്ദ്രതയും വ്യതിയാനവും വർദ്ധിപ്പിക്കുമെന്ന ഞങ്ങളുടെ അനുമാനവുമായി TEM വിശകലനം പൊരുത്തപ്പെടുന്നു.
(AH) 48 മണിക്കൂർ പോസ്റ്റ്-ഫ്യൂഷനിൽ kd സെല്ലുകളിൽ എഫ്-ആക്ടിൻ സ്റ്റെയിനിംഗ് വർദ്ധിച്ചു (T6; A, B).എഫ്-ആക്റ്റിനുമായി (സി, ഡി) ബന്ധപ്പെട്ട മയോസിൻ IIb ന്റെ മാറ്റപ്പെട്ട കളങ്കം.SPECC1L-kd (F, H) സെല്ലുകളിൽ കൺട്രോൾ സെല്ലുകളിൽ (E, G) β-catenin, E-caderin membrane സ്റ്റെയിനിംഗിന്റെ സുഗമമായ പാറ്റേൺ മെച്ചപ്പെടുത്തി.ബാറുകൾ = 10 µm.(I-J) അഗ്ര-ബേസൽ ഇന്റർസെല്ലുലാർ ജംഗ്ഷൻ നിരീക്ഷിക്കുന്ന ഇലക്ട്രോൺ മൈക്രോഗ്രാഫുകൾ.നിയന്ത്രണ സെല്ലുകൾ സ്റ്റിക്കി ജംഗ്ഷനുകളെ (I, അമ്പടയാളങ്ങൾ) സൂചിപ്പിക്കുന്ന ഇലക്ട്രോൺ-സാന്ദ്രമായ പ്രദേശങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു.ഇതിനു വിപരീതമായി, SPECC1L-kd സെല്ലുകളിലെ മുഴുവൻ അഗ്ര-ബേസൽ ജംഗ്ഷനും ഇലക്ട്രോൺ സാന്ദ്രമായ (ജെ, അമ്പടയാളങ്ങൾ) പ്രത്യക്ഷപ്പെട്ടു, ഇത് വർദ്ധിച്ച സാന്ദ്രതയും പശ ജംഗ്ഷനുകളുടെ വ്യാപനവും സൂചിപ്പിക്കുന്നു.(K) β-catenin, SPECC1L-നൊപ്പം ഒത്തുചേരുന്ന U2OS സെൽ ലൈസേറ്റുകളിൽ സഹ-ഇമ്യൂണോപ്രെസിപിറ്റേറ്റ് ചെയ്തു.നാല് സ്വതന്ത്ര പരീക്ഷണങ്ങളിൽ ഒന്നിനെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന ഒരു സ്ഥലത്ത് നിന്ന് എടുത്ത ചിത്രം.
Craniofacial morphogenesis-ൽ SPECC1L-ന്റെ പങ്ക് മനസിലാക്കാൻ, ഞങ്ങൾ രണ്ട് സ്വതന്ത്ര ES ട്രാപ്പ് സെൽ ലൈനുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ഒരു Specc1l കുറവുള്ള മൗസ് മോഡൽ സൃഷ്ടിച്ചു, DTM096, RRH048 (BayGenomics, CA), ഇത് ഇൻട്രോൺ 1, സ്പെക്1എൽ ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റുകൾ എന്നിവയെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു (ചിത്രം 115-ൽ എടുത്തത്). .4A, ചിത്രം S2).ഡികോയ് വെക്റ്റർ ഇൻസേർട്ടിന്റെ ജനിതക സ്ഥാനം മുഴുവൻ ജീനോം സീക്വൻസിംഗിലൂടെ നിർണ്ണയിക്കുകയും പിസിആർ (ചിത്രം എസ് 2) സ്ഥിരീകരിക്കുകയും ചെയ്തു.രണ്ട് ജീൻ ട്രാപ്പ് ഡിസൈനുകളും ക്യാപ്‌ചർ ചെയ്യുമ്പോൾ Specc11-lacZ റിപ്പോർട്ടർമാരുടെ ഇൻ-ഫ്രെയിം ഫ്യൂഷൻ അനുവദിച്ചു.അതിനാൽ, X-gal സ്റ്റെയിനിംഗ് നിർണ്ണയിക്കുന്ന lacZ എക്സ്പ്രഷൻ Specc11 എക്സ്പ്രഷന്റെ സൂചകമായി ഉപയോഗിച്ചു.രണ്ട് അല്ലീലുകളും സമാനമായ lacZ എക്സ്പ്രഷൻ പാറ്റേണുകൾ കാണിച്ചു, ഇൻട്രോൺ 1 ലെ DTM096 ജീൻ ട്രാപ്പ് ഇൻട്രോൺ 15 ലെ RRH048 നേക്കാൾ ശക്തമായ എക്സ്പ്രഷൻ കാണിക്കുന്നു (കാണിച്ചിട്ടില്ല).എന്നിരുന്നാലും, E8.5 (ചിത്രം 4B), ന്യൂറൽ ട്യൂബ്, E9.5, E10.5 (ചിത്രം 4C,D) എന്നിവയിലെ ഫേഷ്യൽ പ്രക്രിയകൾ (ചിത്രം 4C,D) എന്നിവയിലെ ന്യൂറൽ ഫോൾഡുകളിൽ പ്രത്യേകിച്ച് ശക്തമായ പ്രകടനത്തോടെ Specc1l വ്യാപകമായി പ്രകടിപ്പിക്കപ്പെടുന്നു. E10-ൽ.5 ഉം കണ്ണുകളും (ചിത്രം 4D).E10.5 ലെ ആദ്യത്തെ pharyngeal കമാനത്തിലെ SPECC1L എക്സ്പ്രഷൻ, CNCC ലൈനേജുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്ന എപ്പിത്തീലിയത്തിലും അടിവസ്ത്രമായ മെസെൻചൈം18-ലും ഉണ്ടെന്ന് ഞങ്ങൾ മുമ്പ് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തു.CNCC-യിൽ SPECC1L എക്സ്പ്രഷൻ പരിശോധിക്കുന്നതിന്, ഞങ്ങൾ E8.5 ന്യൂറൽ ഫോൾഡുകളും (ചിത്രം 4E-J) E9.5 തലയോട്ടി വിഭാഗങ്ങളും (ചിത്രം 4K-) നടത്തി.E8.5-ൽ, SPECC1L സ്റ്റെയിൻഡ് ന്യൂറൽ ഫോൾഡുകൾ തീവ്രമായി (ചിത്രം. 4E, H), NCC മാർക്കറുകൾ (ചിത്രം 4G, J) ഉപയോഗിച്ച് കളങ്ങൾ ഉൾപ്പെടെ.E9.5-ൽ, SPECC1L (ചിത്രം. 4K, N) AP2A (ചിത്രം. 4L, M) അല്ലെങ്കിൽ SOX10 (ചിത്രം 4O, P) എന്നിവയ്‌ക്കൊപ്പം മൈഗ്രേറ്റിംഗ് CNCC ശക്തമായി സ്റ്റെയിൻ ചെയ്‌തു.
(A) ES DTM096 (ഇൻട്രോൺ 1), RRH048 (ഇൻട്രോൺ 15) സെൽ ക്ലോണുകളിൽ ഡികോയ് വെക്റ്റർ ഉൾപ്പെടുത്തൽ കാണിക്കുന്ന മൗസ് Specc11 ജീനിന്റെ സ്കീമാറ്റിക് പ്രാതിനിധ്യം.(BD) E8.5 മുതൽ E10.5 വരെയുള്ള Specc1l പദപ്രയോഗത്തെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന ഹെറ്ററോസൈഗസ് Specc1lDTM096 ഭ്രൂണങ്ങളുടെ lacZ സ്റ്റെയിനിംഗ്.NE = neuroectoderm, NF = ന്യൂറൽ ഫോൾഡ്, PA1 = ആദ്യത്തെ pharyngeal arch.(EP) E8.5 (NF; EJ) ന്യൂറൽ ഫോൾഡുകളിലും E9.5 (KP) തലയോട്ടി വിഭാഗങ്ങളിലും NCC മാർക്കറുകൾ AP2A, SOX10 എന്നിവയുള്ള SPECC1L ഇമ്മ്യൂണോസ്റ്റൈനിംഗ്.AP2A (F, G; ആരോഹെഡുകൾ), SOX10 (I, J; ആരോഹെഡുകൾ) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് ലേബൽ ചെയ്തിരിക്കുന്ന സെല്ലുകൾ ഉൾപ്പെടെ E8.5 (E, H; ആരോഹെഡുകൾ) ന്യൂറൽ ഫോൾഡുകളിൽ SPECC1L സ്റ്റെയിനിംഗ് വ്യാപകമായി നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു.E9.5-ൽ, AP2A (L, M; അമ്പടയാളങ്ങൾ), SOX10 (O, P; അമ്പടയാളങ്ങൾ) എന്നിങ്ങനെ ലേബൽ ചെയ്‌തിരിക്കുന്ന മൈഗ്രേറ്റിംഗ് CNCC-കൾ (K, N; അമ്പടയാളങ്ങൾ) SPECC1L ശക്തമായി കറപിടിച്ചു.
ഹെറ്ററോസൈഗസ് Specc1lDTM096/+, Specc1lRRH048/+ എലികൾ എന്നിവ തമ്മിലുള്ള ക്രോസിംഗ് കാണിക്കുന്നത് രണ്ട് ജീൻ ട്രാപ്പ് അല്ലീലുകളും പരസ്പര പൂരകങ്ങളല്ലെന്നും ഒന്നുകിൽ ജീൻ ട്രാപ്പ് അല്ലീലിനായി സംയുക്ത ഹെറ്ററോസൈഗോട്ടുകളും ഭ്രൂണ ഹോമോസൈഗോട്ടുകളും ഭ്രൂണ മാരകമാണ് (പട്ടിക S1).മെൻഡലിയൻ അനുപാതങ്ങൾ ജനനസമയത്ത് ഹെറ്ററോസൈഗോട്ടുകളുടെ അതിജീവന നിരക്കിൽ കുറവുണ്ടായതായി സൂചിപ്പിച്ചു (പ്രതീക്ഷിച്ചത് 1.34 vs. 2.0).ഹെറ്ററോസൈഗോട്ടുകളുടെ ഇടയിൽ പെരിനാറ്റൽ മരണനിരക്ക് കുറവാണെന്ന് ഞങ്ങൾ ശ്രദ്ധിച്ചു, ചിലതിൽ തലയോട്ടിയിലെ അപാകതകൾ (ചിത്രം എസ് 3).എന്നിരുന്നാലും, ഈ പെരിനാറ്റൽ ക്രാനിയോഫേഷ്യൽ ഫിനോടൈപ്പുകളുടെ കുറഞ്ഞ നുഴഞ്ഞുകയറ്റം അവയുടെ അടിസ്ഥാന പാത്തോഫിസിയോളജിക്കൽ മെക്കാനിസങ്ങൾ പഠിക്കുന്നത് ബുദ്ധിമുട്ടാക്കുന്നു.അതിനാൽ, ഞങ്ങൾ ഹോമോസൈഗസ് സ്പെക്ക്11 മ്യൂട്ടന്റുകളുടെ ഭ്രൂണ മാരകമായ പ്രതിഭാസത്തിൽ ശ്രദ്ധ കേന്ദ്രീകരിച്ചു.
മിക്ക സംയുക്ത ഹെറ്ററോസൈഗസ് അല്ലെങ്കിൽ ഹോമോസൈഗസ് Specc1lDTM096/RRH048 മ്യൂട്ടന്റ് ഭ്രൂണങ്ങൾ E9.5-10.5 (ചിത്രം. 5A-D) ന് ശേഷം വികസിച്ചില്ല, കൂടാതെ ന്യൂറൽ ട്യൂബ് മുൻവശത്ത് അടഞ്ഞില്ല (ചിത്രം. 5B, D) ചിലപ്പോൾ പിന്നിലേക്ക് അടഞ്ഞില്ല (കാണിച്ചിട്ടില്ല) ..ഈ തലയോട്ടിയിലെ ന്യൂറൽ ട്യൂബ് ക്ലോഷർ വൈകല്യം E10.5-ലെ ന്യൂറൽ ഫോൾഡുകളിൽ ശേഷിക്കുന്ന DLX2 എന്ന് അടയാളപ്പെടുത്തിയ CNCC യുടെ ഭൂരിഭാഗവുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു, ഇത് ഡിസെക്ഷൻ ഇല്ലെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു (ചിത്രം 5A'-D').CNCC യുടെ മൊത്തത്തിലുള്ള വലിപ്പവും കുറഞ്ഞോ എന്ന് നിർണ്ണയിക്കാൻ, Wnt1-Cre, ROSAmTmG എന്നിവയുള്ള ഞങ്ങളുടെ ജീൻ ട്രാപ്പ് ലൈനുകളിൽ GFP ഉള്ള CNCC ലൈനുകൾ ഞങ്ങൾ ടാഗ് ചെയ്തു.മുഴുവൻ ഭ്രൂണങ്ങളിൽ നിന്നും ഞങ്ങൾ തരംതിരിച്ച GFP+ NCC, GFP- (RFP+) നോൺ-എൻസിസി സ്ട്രീം ചെയ്യുന്നു.E9.5-ൽ, ഫ്ലോ-സോർട്ടഡ് GFP-ലേബൽ ചെയ്ത CNCC-കളുടെ അനുപാതം WT-ക്കും മ്യൂട്ടന്റ് ഭ്രൂണങ്ങൾക്കും ഇടയിൽ കാര്യമായ മാറ്റമുണ്ടായില്ല (കാണിച്ചിട്ടില്ല), ഇത് സാധാരണ CNCC സ്പെസിഫിക്കേഷനെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.അതിനാൽ, എക്സ്പോസ്ഡ് ന്യൂറൽ ഫോൾഡുകളിൽ (ചിത്രം 5 ബി') ശേഷിക്കുന്ന Wnt1-Cre, DLX2 സ്റ്റെയിനിംഗ് വികലമായ CNCC ലേയറിംഗ് മൂലമാണെന്ന് ഞങ്ങൾ അനുമാനിക്കുന്നു, SPECC1L-kd സെല്ലുകളിൽ കാണുന്നത് പോലെ, AJ സെല്ലുകളുടെ വർദ്ധിച്ച സാന്ദ്രതയോ ചിതറിപ്പോയതിനാലോ ആയിരിക്കാം.ന്യൂറൽ ഫോൾഡിൽ CNCC യുടെ സാന്നിധ്യം സ്ഥിരീകരിക്കാൻ ഞങ്ങൾ NCC മാർക്കറുകൾ SOX10, AP2A, DLX2 എന്നിവ ഉപയോഗിച്ചു (ചിത്രം 5E-R).E8.5-ൽ, WT (ചിത്രം 5E, G, I), Specc1l മ്യൂട്ടന്റ് (ചിത്രം 5F, H, J) എന്നീ വിഭാഗങ്ങളിൽ മൂന്ന് NCC മാർക്കറുകൾക്കും ന്യൂറൽ ഫോൾഡ് സ്റ്റെയിനിംഗ് നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു.E9.5-ൽ, NCC മാർക്കറുകൾ WT വിഭാഗങ്ങളിൽ (ചിത്രം 5M, O, Q) മൈഗ്രേറ്റിംഗ് NCC കളങ്കപ്പെടുത്തിയപ്പോൾ, Specc1l മ്യൂട്ടന്റ് ഭ്രൂണങ്ങളുടെ (ചിത്രം. 5N, P, R) തുറന്ന ന്യൂറൽ ഫോൾഡുകളിൽ ശേഷിക്കുന്ന NCC സ്റ്റെയിനിംഗ് നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു.SOX10, DLX2 എന്നിവ CNCC-കളെ മൈഗ്രേറ്റുചെയ്യുന്നതായി അടയാളപ്പെടുത്തുന്നതിനാൽ, ഈ ഫലം സൂചിപ്പിക്കുന്നത് SPECC1L-അപര്യാപ്തമായ CNCC-കൾ മൈഗ്രേറ്ററിക്ക് ശേഷമുള്ള സ്പെസിഫിക്കേഷൻ കൈവരിക്കുകയും എന്നാൽ ന്യൂറൽ ഫോൾഡുകളിൽ നിന്ന് മൈഗ്രേറ്റ് ചെയ്യുന്നതിൽ പരാജയപ്പെടുകയും ചെയ്യുന്നു.
Specc11 ന്റെ കുറവ് ന്യൂറൽ ട്യൂബ് അടയുന്നതിലേക്കും തലയോട്ടിയിലെ ന്യൂറൽ ക്രെസ്റ്റ് സെല്ലുകളുടേയും എജെകളുടേയും ഡീലാമിനേഷനിലേക്കും നയിക്കുന്നു.
(A, B') E9.5 WT (A) Wnt1-Cre (A') എന്ന് ലേബൽ ചെയ്‌ത മൈഗ്രേറ്റിംഗ് ക്രാനിയൽ ന്യൂറൽ ക്രെസ്റ്റ് സെല്ലുകളെ (CNCC) വഹിക്കുന്ന ഭ്രൂണം.ഇതിനു വിപരീതമായി, Specc11 മ്യൂട്ടന്റ് ഭ്രൂണങ്ങൾ തുറന്ന ന്യൂറൽ ഫോൾഡുകളും (B), ആരോഹെഡുകളും മൈഗ്രേറ്റ് ചെയ്യാത്ത CNCC കളും (B', arrowheads) കാണിക്കുന്നു.(C, D') E10.5 WT ഭ്രൂണങ്ങളുടെ (C, C'), Specc1l (D, D') CNCC മാർക്കർ DLX2-ന്റെ ബ്രൈറ്റ് ഫീൽഡ് ഇമേജുകളും (C, D') ഇമ്മ്യൂണോസ്റ്റൈനിംഗും (C', D').WT E10.5 ഭ്രൂണങ്ങളിൽ, DLX2-പോസിറ്റീവ് CNCC ഗിൽ ആർച്ചുകളെ (C', അമ്പടയാളങ്ങൾ) കോളനിവൽക്കരിക്കുന്നു, അതേസമയം മ്യൂട്ടന്റുകളിൽ, തുറന്ന ന്യൂറൽ ഫോൾഡുകളിലും (D', അമ്പടയാളങ്ങൾ), ആദ്യത്തെ pharyngeal ആർച്ചുകളിലും (D',) പ്രകടമായ പാടുകൾ നിലനിൽക്കുന്നു. അമ്പുകൾ).) CNCC യുടെ മോശം ഡീലാമിനേഷനും മൈഗ്രേഷനും സൂചിപ്പിക്കുന്ന ചില സ്റ്റെയിനിംഗ് (അമ്പുകൾ) കൂടെ.ER) E8.5 (E-L), E9.5 (M-R) ഘട്ടങ്ങളിലെ WT, Specc1l മ്യൂട്ടന്റ് ഭ്രൂണങ്ങളുടെ വിഭാഗങ്ങൾ NCC മാർക്കറുകൾ SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H,) ഉപയോഗിച്ച് ലേബൽ ചെയ്‌തു. O, P ), DLX2 (I, J, Q, R).E8.5-ൽ, വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് ന്യൂറൽ ഫോൾഡിലും (NF) മ്യൂട്ടന്റ് വിഭാഗങ്ങളിലും NCC സ്റ്റെയിനിംഗ് നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു.E8.5 WT (K), മ്യൂട്ടന്റ് (L) എന്നിവയിലെ SOX10, β-catenin എന്നിവയുടെ കോ-സ്റ്റെയിനിംഗ്, ന്യൂറൽ ഫോൾഡുകളിലെ സെൽ അതിരുകളിൽ വർദ്ധിച്ച β-കാറ്റെനിൻ സ്റ്റെയിനിംഗ് വെളിപ്പെടുത്തി.E9.5-ൽ, മൈഗ്രേറ്റിംഗ് CNCC-കളുടെ (M, O, Q) വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് സ്റ്റെയിനിംഗ് നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു, അതേസമയം മ്യൂട്ടന്റുകളിൽ, തരംതിരിവില്ലാത്ത CNCC-കൾ തുറന്ന ന്യൂറൽ ഫോൾഡുകൾ (N, P, R).(S-Z) E9.5 മ്യൂട്ടേഷനോടുകൂടിയ WT, Specc11DTM096/RRH048 ഭ്രൂണങ്ങളുടെ കൊറോണൽ വിഭാഗങ്ങളിലെ vivo AJ ലേബലിംഗ് വിശകലനത്തിൽ.മുകളിൽ വലത് കോണിൽ ഒരു ഏകദേശ വിഭാഗ തലം കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.മ്യൂട്ടന്റ് ടിഷ്യൂകളുടെ വിഭാഗങ്ങളിൽ, എഫ്-ആക്റ്റിൻ (എസ്, ടി), മയോസിൻ ഐഐബി (യു, വി) എന്നിവയുടെ വർദ്ധിച്ച സ്റ്റെയിനിംഗ് നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു.ചിത്രം 3-ലെ ഇൻ വിട്രോ ഫലങ്ങൾക്ക് സമാനമായി, മ്യൂട്ടന്റ് ഭ്രൂണങ്ങളിൽ, β-കാറ്റെനിൻ (W, X), ഇ-കാദറിൻ (Y, Z) എന്നിവയ്‌ക്കായുള്ള മെച്ചപ്പെടുത്തിയ മെംബ്രൺ സ്റ്റെയിനിംഗ് നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു.(AA-BB) അഗ്ര-ബേസൽ സെല്ലിന്റെ അതിർത്തിക്കപ്പുറത്തേക്ക് നോക്കുന്ന ഒരു വന്യ-തരം ഭ്രൂണത്തിന്റെ ഒരു വിഭാഗത്തിന്റെ ഇലക്ട്രോൺ മൈക്രോഗ്രാഫ്, പശ ജംഗ്ഷനുകളെ (AA, അമ്പടയാളങ്ങൾ) സൂചിപ്പിക്കുന്ന ഒരു പ്രത്യേക ഇലക്ട്രോൺ-സാന്ദ്രമായ പ്രദേശം കാണിക്കുന്നു.ഇതിനു വിപരീതമായി, Specc11 മ്യൂട്ടന്റ് ഭ്രൂണങ്ങളുടെ (BB, അമ്പുകൾ) വിഭാഗങ്ങളിൽ, മുഴുവൻ apicobasal ജംഗ്ഷനും ഇലക്ട്രോൺ സാന്ദ്രമാണ്, ഇത് പശ ജംഗ്ഷനുകളുടെ വർദ്ധിച്ച സാന്ദ്രതയും വ്യാപനവും സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
മാറ്റം വരുത്തിയ AJ കാരണമാണ് ലെയറിംഗ് കുറയുന്നത് എന്ന ഞങ്ങളുടെ അനുമാനം പരിശോധിക്കാൻ, Specc1l മ്യൂട്ടന്റ് ഭ്രൂണങ്ങളുടെ (ചിത്രം 5S-Z) തുറന്ന ന്യൂറൽ ഫോൾഡുകളിൽ AJ ലേബലിംഗ് ഞങ്ങൾ പരിശോധിച്ചു.ആക്റ്റിൻ സ്ട്രെസ് ഫൈബറുകളുടെ വർദ്ധനവും (ചിത്രം. 5 എസ്, ടി) ആക്റ്റിൻ നാരുകളിൽ മയോസിൻ IIB സ്റ്റെയിനിംഗിന്റെ അനുരൂപമായ വർദ്ധിച്ച പ്രാദേശികവൽക്കരണവും ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു (ചിത്രം. 5 യു, വി).പ്രധാനമായി, ഇന്റർസെല്ലുലാർ അതിരുകളിൽ β-കാറ്റെനിൻ (ചിത്രം. 5W,X), ഇ-കാഥറിൻ (ചിത്രം. 5Y,Z) എന്നിവയുടെ കളങ്കം വർദ്ധിക്കുന്നത് ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു.E8.5 ഭ്രൂണങ്ങളുടെ ന്യൂറൽ ഫോൾഡുകളിൽ NCC യുടെ β-catenin സ്റ്റെയിനിംഗും ഞങ്ങൾ പരിശോധിച്ചു (ചിത്രം 5K, L).Specc1l മ്യൂട്ടന്റ് ന്യൂറൽ ഫോൾഡുകളിൽ (ചിത്രം. 5L, K) β-catenin സ്റ്റെയിനിംഗ് ശക്തമായതായി കാണപ്പെട്ടു, ഇത് AJ മാറ്റങ്ങൾ ആരംഭിച്ചതായി സൂചിപ്പിക്കുന്നു.E9.5 ഭ്രൂണങ്ങളുടെ തലയോട്ടി വിഭാഗങ്ങളിലെ ഇലക്‌ട്രോൺ മൈക്രോഗ്രാഫുകളിൽ, WT (ചിത്രം 5AA, BB, S1E-H) യുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ Specc1l മ്യൂട്ടന്റ് ഭ്രൂണങ്ങളിൽ വ്യാപിക്കുന്ന ഇലക്‌ട്രോൺ-സാന്ദ്രമായ കറ ഞങ്ങൾ വീണ്ടും നിരീക്ഷിച്ചു.ഒരുമിച്ച് എടുത്താൽ, ഈ ഫലങ്ങൾ SPECC1L-kd U2OS സെല്ലുകളിലെ ഞങ്ങളുടെ ഇൻ വിട്രോ ഫലങ്ങളെ പിന്തുണയ്‌ക്കുന്നു, കൂടാതെ ഞങ്ങളുടെ മ്യൂട്ടന്റ് ഭ്രൂണങ്ങളിലെ CNCC സ്‌ട്രാറ്റിഫിക്കേഷന് മുമ്പുള്ള വ്യതിചലന AJ സ്റ്റെയിനിംഗ് നിർദ്ദേശിക്കുന്നു.
AKT പ്രവർത്തനവും ഇ-കാഥറിൻ സ്ഥിരതയും തമ്മിലുള്ള അറിയപ്പെടുന്ന വിരുദ്ധ ബന്ധം കണക്കിലെടുത്ത്, 17,28 PI3K-AKT സിഗ്നലിംഗിന്റെ പങ്കാളിത്തം ഞങ്ങൾ അനുമാനിച്ചു.കൂടാതെ, E9.5-10.5-ൽ മാരകാവസ്ഥയിൽ നിന്ന് (<5%) രക്ഷപ്പെടുകയും പകരം E13.5-ൽ സ്ഥിരതാമസമാക്കുകയും ചെയ്ത ഞങ്ങളുടെ ചില മ്യൂട്ടന്റ് ഭ്രൂണങ്ങളിൽ ഞങ്ങൾ സബ്‌പിഡെർമൽ ബ്ലസ്റ്ററിംഗ് നിരീക്ഷിക്കുകയും ചെയ്തു (ചിത്രം S3).PDGFRα12 അടിസ്ഥാനമാക്കി കുറഞ്ഞ PI3K-AKT സിഗ്നലിംഗിന്റെ മുഖമുദ്രയാണ് സബ്പിഡെർമൽ വെസിക്കിളുകൾ.Fantauzzo et al.(2014) PdgfraPI3K/PI3K മ്യൂട്ടന്റ് ഭ്രൂണങ്ങളിൽ PDGFRα അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള PI3K ആക്റ്റിവേഷൻ തടസ്സപ്പെടുന്നത് സബ്‌പിഡെർമൽ വെസിക്കിളുകൾ, ന്യൂറൽ ട്യൂബ് വൈകല്യങ്ങൾ, പിളർപ്പ് അണ്ണാക്ക് പ്രതിഭാസങ്ങൾ എന്നിവയ്ക്ക് കാരണമാകുന്നു.തീർച്ചയായും, pan-AKT, സജീവ ഫോസ്ഫോറിലേറ്റഡ് Ser473-AKT എന്നിവയുടെ അളവ് Specc1l മ്യൂട്ടന്റ് ടിഷ്യൂകളിലെ vivo-ൽ E9.5 ഭ്രൂണ അറസ്റ്റിലേക്ക് കുറഞ്ഞു (ചിത്രം 6A-D).ഫോസ്ഫോറിലേറ്റഡ് സെർ473-എകെടിയുടെ അളവ് കുറയുന്നത് വിവോയിലും (FIG. 6E), ഇൻ വിട്രോയിലും (FIG. 6F) പാൻ-എകെടിയുടെ അളവ് കുറയുന്നത് മൂലമാകാം.U2OS സെല്ലുകൾ സെൽ ആകൃതിയിലും എജെ സാന്ദ്രതയിലും മാറ്റങ്ങളുമായി ശക്തമായി സംയോജിച്ചപ്പോൾ മാത്രമാണ് ഇൻ വിട്രോ കുറയുന്നത് നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടത് (ചിത്രം 6D).അതിനാൽ, ക്രാനിയോഫേഷ്യൽ മോർഫോജെനിസിസിലെ PI3K-AKT സിഗ്നലിംഗിന്റെ ഒരു പുതിയ പോസിറ്റീവ് റെഗുലേറ്ററാണ് SPECC1L എന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
(A-E) E8.5 (A,B), E9.5 (C,D) തലയോട്ടി വിഭാഗങ്ങൾ അല്ലെങ്കിൽ Specc1l മ്യൂട്ടന്റ് ഭ്രൂണങ്ങളിൽ നിന്നുള്ള E9.5 ലൈസറ്റുകൾ (E) സജീവ ഫോസ്ഫോറിലേറ്റഡ് S473-AKT, pan-AKT പ്രോട്ടീൻ കുറയ്ക്കൽ എന്നിവയുടെ അളവ് കാണിക്കുന്നു , കൺട്രോൾ WT യുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ.വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ടിംഗ് വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് ലൈസേറ്റുകളിലും മ്യൂട്ടന്റ് ലൈസേറ്റുകളിലും ഒരേ അവസ്ഥയിൽ നടത്തി.SPECC1L-നായി കാണിച്ചിരിക്കുന്ന ചിത്രങ്ങൾ ഒരു ബ്ലോട്ടിൽ നിന്ന് എടുത്തതാണ്.ഇതേ ബ്ലോട്ട് നീക്കം ചെയ്യുകയും ആന്റി-പാൻ-എസിടി, β-ആക്റ്റിൻ ആന്റിബോഡികൾ എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് വീണ്ടും പരിശോധിക്കുകയും ചെയ്തു.E8.5 ന്യൂറൽ ഫോൾഡുകളിലെ (A, B) പാൻ-AKT ലെവലും E9.5 തലയോട്ടി വിഭാഗങ്ങളിലെ ഫോസ്ഫോറിലേറ്റഡ് S473-AKT ലെവലും ഗണ്യമായി കുറഞ്ഞു.(എഫ്) ഉയർന്ന സംഗമസ്ഥാനത്ത് വിളവെടുത്ത SPECC1L-kd U2OS സെല്ലുകളുടെ ലൈസേറ്റുകളിൽ പാൻ-എകെടി അളവ് സമാനമായി കുറച്ചു.പിശക് ബാറുകൾ മൂന്ന് സ്വതന്ത്ര വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ട് ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷനുകളിൽ നിന്നുള്ള SEM-കളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.(GJ) E9.5-ലെ WT ഭ്രൂണങ്ങളുടെ ഭാഗങ്ങൾ യഥാക്രമം KI67, ക്ലീവ്ഡ് കാസ്‌പേസ് 3 എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് കോശങ്ങളുടെ വ്യാപനവും (G, G') ചെറിയ അപ്പോപ്റ്റോട്ടിക് പ്രവർത്തനവും (H, H') കാണിക്കുന്നു.Specc11 മ്യൂട്ടന്റ് ഭ്രൂണങ്ങൾ താരതമ്യപ്പെടുത്താവുന്ന സെൽ പ്രൊലിഫെറേഷൻ (I) കാണിക്കുന്നു, എന്നാൽ അപ്പോപ്റ്റോസിസിന് വിധേയമാകുന്ന കോശങ്ങളുടെ എണ്ണം ഗണ്യമായി വർദ്ധിക്കുന്നു (J).
തുടർന്ന് ഞങ്ങൾ വ്യാപനത്തിന്റെയും അപ്പോപ്റ്റോസിസിന്റെയും അടയാളങ്ങൾ പരിശോധിച്ചു.WT മ്യൂട്ടന്റുകൾക്ക് 82.5% പ്രൊലിഫെറേഷൻ സൂചികയും KI67 സ്റ്റെയിനിംഗ് (p <0.56, ഫിഷേഴ്‌സ്) കണക്കാക്കിയ Specc1l മ്യൂട്ടന്റുകൾക്ക് 86.5% ഉം ഉള്ള E9.5 ഭ്രൂണങ്ങളുടെ വ്യാപനത്തിൽ (ചിത്രം 6E, G-യുമായി താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ G) ഒരു വ്യത്യാസവും ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചില്ല. കൃത്യമായ പരിശോധന).അതുപോലെ, E8.5-ൽ ന്യൂറൽ ഫോൾഡുകളിൽ ക്ലീവ്ഡ് കാസ്‌പേസ് 3-ന്റെ സ്റ്റെയിൻ ഉപയോഗിച്ച് അളക്കുന്ന അപ്പോപ്‌ടോസിസിൽ ഭ്രൂണ അറസ്റ്റ് വരെ (കാണിച്ചിട്ടില്ല) (കാണിച്ചിട്ടില്ല) ഒരു വ്യത്യാസവും ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചില്ല.ഇതിനു വിപരീതമായി, എല്ലാ E9.5 മ്യൂട്ടന്റ് ഭ്രൂണങ്ങളിലും അപ്പോപ്റ്റോസിസ് ഗണ്യമായി വർദ്ധിച്ചു (ചിത്രം 6F, H, J).അപ്പോപ്‌ടോസിസിന്റെ മൊത്തത്തിലുള്ള ഈ വർദ്ധനവ് കുറയുന്ന PI3K-AKT സിഗ്നലിംഗും ആദ്യകാല ഭ്രൂണ മാരകതയും 29,30,31 എന്നിവയുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു.
അടുത്തതായി, ഞങ്ങളുടെ kd സെല്ലുകളിലെ AJ മാറ്റങ്ങളിൽ PI3K-AKT സിഗ്നലിംഗിനുള്ള ഒരു കാരണമായ പങ്ക് സ്ഥിരീകരിക്കുന്നതിന്, നിയന്ത്രണത്തിലും kd സെല്ലുകളിലും ഉള്ള പാത ഞങ്ങൾ രാസപരമായി മാറ്റി (ചിത്രം 7A-F).സംഗമിക്കുന്ന SPECC1L-kd സെല്ലുകളിൽ നിരീക്ഷിച്ച സെൽ ഷേപ്പ് മാറ്റ ഫിനോടൈപ്പ് ഞങ്ങൾ ഒരു മാർക്കറായി ഉപയോഗിച്ചു, അത് ഏറ്റവും ദൈർഘ്യമേറിയ അളവും (നീളവും) അനുബന്ധ ലംബ അളവും (വീതി) തമ്മിലുള്ള അനുപാതം ഉപയോഗിച്ച് ഞങ്ങൾ കണക്കാക്കുന്നു.താരതമ്യേന വൃത്താകൃതിയിലുള്ള അല്ലെങ്കിൽ ക്യൂബോയിഡൽ സെല്ലുകൾക്ക് 1 എന്ന അനുപാതം പ്രതീക്ഷിക്കുന്നു (ചിത്രം 7G).സെൽ ആകൃതിക്ക് പുറമേ, β-കാറ്റെനിൻ സ്റ്റെയിനിംഗ് (ചിത്രം 7A'-F') വഴിയും ഞങ്ങൾ AJ-യിൽ സ്വാധീനം സ്ഥിരീകരിച്ചു.കൺട്രോൾ സെല്ലുകളിലും (ചിത്രം 7A,C), AJ (ചിത്രം 7A') സെല്ലുകളുടെ ആകൃതി മാറ്റാൻ wortmannin ഉപയോഗിച്ചുള്ള PI3K-AKT പാതയുടെ തടസ്സം മതിയായിരുന്നു.PI3K-AKT ആക്റ്റിവേറ്റർ SC-79 നിയന്ത്രണ സെല്ലുകളിലെ സെൽ ആകൃതിയെ (FIG. 7A, E) അല്ലെങ്കിൽ AJ വികാസത്തെ (FIG. 7A') ബാധിച്ചില്ല.SPECC1L-kd സെല്ലുകളിൽ, PI3K-AKT പാത്ത്‌വേയെ കൂടുതൽ അടിച്ചമർത്തുന്നത് അപ്പോപ്റ്റോസിസിന്റെ വർദ്ധനവിനും (ചിത്രം. 7B,D) β-catenin സ്റ്റെയിനിംഗിൽ (ചിത്രം. 7B') പ്രകടമായ വർദ്ധനവിനും കാരണമായി, നമ്മുടെ ഇൻ വിവോ ഹെവി മ്യൂട്ടന്റുകളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു.പ്രധാനമായും, PI3K-AKT പാത്ത്‌വേ സജീവമാക്കുന്നത് സെൽ ആകൃതിയും (ചിത്രം 7B,F), AJ ഫിനോടൈപ്പുകളും (ചിത്രം 7B") ഗണ്യമായി മെച്ചപ്പെടുത്തി.സെൽ ആകൃതിയിലുള്ള മാറ്റങ്ങൾ സെൽ റൗണ്ട്‌നെസ് റേഷ്യോ (CCR) ആയി കണക്കാക്കുകയും മുകളിൽ വിവരിച്ചതുപോലെ പ്രാധാന്യത്തിനായി താരതമ്യം ചെയ്യുകയും ചെയ്തു (FIG. 7G).തീർച്ചയായും, കൺട്രോൾ സെല്ലുകളിൽ (ചിത്രം. 7G, CCR = 1.56), നിരീക്ഷിച്ചതിന് സമാനമായ അളവിൽ സെൽ ആകൃതിയിൽ (ചിത്രം. 7G, CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9) കാര്യമായ മാറ്റം വരുത്താൻ wortmannin ചികിത്സ മതിയായിരുന്നു. SPECC1L-ൽ.-kd സെല്ലുകൾ (ചിത്രം 7G, CCR = 3.46).SPECC1L-kd സെല്ലുകളുടെ Wortmannin ചികിത്സ (ചിത്രം. 7G, CCR = 3.60, നിസ്സാരമായത്) ചികിത്സിക്കാത്ത kd സെല്ലുകളേക്കാൾ (ചിത്രം. 7G, CCR = 3.46, നിസ്സാരമായത്) അല്ലെങ്കിൽ wortmannin- ചികിത്സിച്ച നിയന്ത്രണ സെല്ലുകളേക്കാൾ (ചിത്രം 7G) പ്രാധാന്യമില്ല., CCR = 3.46, നിസ്സാരമായത്) അധികമായി സെൽ ദീർഘിപ്പിക്കലിനെ ബാധിക്കുന്നു (7G, CCR = 3.61, നിസ്സാരം).ഏറ്റവും പ്രധാനമായി, SC-79 AKT ആക്റ്റിവേറ്റർ SPECC1L-kd സെല്ലുകളുടെ നീളമേറിയ ഫിനോടൈപ്പ് പുനഃസ്ഥാപിച്ചു (ചിത്രം. 7G, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).ഈ ഫലങ്ങൾ SPECC1L PI3K-AKT സിഗ്നലിംഗിനെ നിയന്ത്രിക്കുന്നുവെന്നും SPECC1L ലെ മിതമായ കുറവ് സെൽ അഡീഷനെ ബാധിക്കുമെന്നും നിർദ്ദേശിക്കുന്നു, അതേസമയം ശക്തമായ കുറവ് അപ്പോപ്റ്റോസിസിലേക്ക് നയിക്കുന്നു (ചിത്രം 8).
(A-F') നിയന്ത്രണവും (A, C, E) SPECC1L-kd (B, D, F) സെല്ലുകളും PI3K-AKT പാത്ത്‌വേ ഇൻഹിബിറ്റർ wortmannin (C, D) അല്ലെങ്കിൽ SC-79 ആക്റ്റിവേറ്റർ (E, F) ചികിത്സ ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിക്കുന്നു .ചികിത്സയില്ലാത്ത കൺട്രോൾ സെല്ലുകൾ സാധാരണ β-കാറ്റ് സെല്ലുലാർ സ്റ്റെയിനിംഗ് (എ') ഉള്ള ക്യൂബോയിഡൽ (എ) ആണ്, അതേസമയം കെഡി സെല്ലുകൾ നീളമേറിയതാണ് (ബി) വർദ്ധിച്ച β-കാറ്റ് സ്റ്റെയിനിംഗ് (ബി').PI3K-AKT പാത്ത്‌വേ അടിച്ചമർത്തലിനുശേഷം, β-കാറ്റ് വിപുലീകരണത്തോടുകൂടിയ (C') നീളമേറിയ (C) സെല്ലുകളെ നിയന്ത്രിക്കുന്നു, അതേസമയം kd കോശങ്ങൾ അപ്പോപ്‌ടോസിസ് (D) വിധേയമാകാൻ തുടങ്ങി, നമ്മുടെ ഉയർന്ന പരിവർത്തനം സംഭവിച്ച ഭ്രൂണങ്ങൾക്ക് സമാനമായതും അത്യധികം മെച്ചപ്പെടുത്തിയ β-പൂച്ച കാണിക്കുന്നു.സ്റ്റെയിനിംഗ് (ഡി').PI3K-AKT പാത്ത്‌വേ സജീവമാക്കിയതിന് ശേഷം, നിയന്ത്രണ സെല്ലുകൾ ക്യൂബോയിഡൽ (E) ആയി തുടരുകയും സാധാരണ β-cat (E') സ്റ്റെയിനിംഗ് ഉണ്ടായിരിക്കുകയും ചെയ്തു, അതേസമയം kd സെല്ലുകൾ ഗണ്യമായി മെച്ചപ്പെട്ട സെൽ ആകൃതിയും (F) β-cat (F') സ്റ്റെയിനിംഗും കാണിക്കുന്നു. (ജി) മെറ്റാമോർഫ് സോഫ്‌റ്റ്‌വെയർ ഉപയോഗിച്ച് ഏറ്റവും ദൈർഘ്യമേറിയ അളവിന്റെ (നീളം) സെൽ റൗണ്ട്‌നെസ് റേഷ്യോ (സിസിആർ) യും അനുബന്ധ ലംബ അളവും (വീതി) ഉപയോഗിച്ചാണ് (എഎഫ്) സെൽ ആകൃതി മാറ്റത്തിന്റെ അളവ് കണക്കാക്കുന്നത്.ചികിത്സയില്ലാത്ത (NT) SPECC1L-kd സെല്ലുകൾ (CCR = 3.46) കൺട്രോൾ സെല്ലുകളേക്കാൾ (CCR = 1.56, p <6.1 × 10-13) ദൈർഘ്യമേറിയതാണ്.കൺട്രോൾ സെല്ലുകളിലെ PI3K-AKT പാത്ത്‌വേയുടെ വോർട്ടിന്റെ തടസ്സം, സെൽ ആകൃതിയിൽ സമാനമായ നീളം ഉണ്ടാക്കാൻ പര്യാപ്തമാണ് (CCR=3.61, p<2.4×10-9).അതുപോലെ, SPECC1L-kd സെല്ലുകളിൽ SC-79 മുഖേനയുള്ള AKT ആക്ടിവേഷൻ ലെവലിലേക്ക് സെല്ലിന്റെ നീളം പുനഃസ്ഥാപിച്ചു (CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).SPECC1L-kd സെല്ലുകളുടെ വോർട്ട്‌മാന്നിൻ ചികിത്സ അപ്പോപ്‌ടോസിസ് വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് കാരണമായി, എന്നാൽ ചികിത്സിക്കാത്ത kd (CCR=3.46, ns) അല്ലെങ്കിൽ wortmannin- ചികിത്സിച്ച കൺട്രോൾ സെല്ലുകളെ (3.61) അപേക്ഷിച്ച് കോശത്തിന്റെ ആകൃതിയിൽ മാറ്റം വരുത്തിയിട്ടില്ല (CCR=3.60).ns = പ്രശ്നമല്ല.+/- 50 സെല്ലുകൾക്കുള്ള SEM അളവുകൾ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.വിദ്യാർത്ഥികളുടെ ടി-ടെസ്റ്റ് ഉപയോഗിച്ചാണ് സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ വ്യത്യാസങ്ങൾ കണക്കാക്കിയത്.
(A) യഥാക്രമം AJ മാറ്റങ്ങൾക്കും രക്ഷാപ്രവർത്തനത്തിനും കാരണമാകുന്ന PI3K-AKT പാതയുടെ തടസ്സത്തിന്റെയും സജീവമാക്കലിന്റെയും സ്കീമാറ്റിക് പ്രാതിനിധ്യം.(B) SPECC1L മുഖേന AKT പ്രോട്ടീൻ സ്ഥിരതയ്ക്കായി നിർദ്ദേശിക്കപ്പെട്ട മാതൃക.
പ്രീമിഗ്രേറ്ററി CNCC-കൾക്ക് മുൻ ന്യൂറൽ ഫോൾഡ് ന്യൂറോപിത്തീലിയൽ സെല്ലുകളിൽ നിന്ന് വേർപെടുത്താൻ AJ ലിസിസ് ആവശ്യമാണ് 1,15,32.SPECC1L-ന്റെ β-catenin-ന്റെ ഭൗതിക സാമീപ്യവും, SPECC1L-ന്റെ β-catenin-നും ചേർന്ന് SPECC1L-ന്റെ കുറവുള്ള SPECC1L-ലെ അസിമട്രിക് ഡിസ്ട്രിബ്യൂഷൻ, AJ ഘടകങ്ങളുടെ കളങ്കം വർധിച്ചതും, SPECC1L-ന്റെ പ്രവർത്തനങ്ങളെ സൂചിപ്പിക്കുന്നത്. സംഘടന പേശികൾ.ആക്ടിൻ സൈറ്റോസ്കെലിറ്റൺ.SPECC1L-ന്റെ ആക്ടിൻ സൈറ്റോസ്‌കെലിറ്റൺ, β-കാറ്റെനിൻ എന്നിവയുമായുള്ള ബന്ധവും SPECC1L-ന്റെ അഭാവത്തിൽ ബാഷ്പീകരിച്ച ആക്റ്റിൻ ഫിലമെന്റുകളുടെ എണ്ണത്തിലുള്ള വർദ്ധനവും AJ സാന്ദ്രതയിലെ നിരീക്ഷിച്ച വർദ്ധനയുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു.SPECC1L-അപര്യാപ്തമായ കോശങ്ങളിലെ ആക്റ്റിൻ നാരുകളുടെ എണ്ണം കൂടുന്നത് ഇന്റർസെല്ലുലാർ ടെൻഷനിലെ മാറ്റത്തിലേക്ക് നയിക്കുന്നു എന്നതാണ് മറ്റൊരു സാധ്യത.സെല്ലുലാർ സ്ട്രെസ് AJ 33 ഡൈനാമിക്സിനെ ബാധിക്കുന്നതിനാൽ, വോൾട്ടേജ് മാറ്റങ്ങൾ കൂടുതൽ വ്യാപിക്കുന്ന AJ 34 ന് കാരണമാകും.അതിനാൽ ഏത് മാറ്റവും CNCC ലെയറുകളെ ബാധിക്കും.
ന്യൂറൽ ക്രെസ്റ്റ് സെല്ലുകൾക്ക് കാരണമാകുന്ന ആദ്യകാല ന്യൂറൽ ഫോൾഡുകളിൽ Wnt1 പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു.അങ്ങനെ, Wnt1-cre ലൈനേജ് ട്രെയ്‌സിംഗ് NCC35-ന് മുമ്പുള്ളതും മൈഗ്രേറ്റുചെയ്യുന്നതും അടയാളപ്പെടുത്തുന്നു.എന്നിരുന്നാലും, ആദ്യകാല ന്യൂറൽ ഫോൾഡുകൾ 35,36 ൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞ ഡോർസൽ ബ്രെയിൻ ടിഷ്യു ക്ലോണുകളും Wnt1 അടയാളപ്പെടുത്തുന്നു, ഇത് തുറന്ന ന്യൂറൽ ഫോൾഡുകളിൽ Wnt1 മാർക്കറുകൾക്കായി E9.5 മ്യൂട്ടന്റുകളുടെ കറ സിഎൻസിസി അല്ലെന്ന് ഇത് സാധ്യമാക്കുന്നു.NCC മാർക്കറുകൾ AP2A, SOX10 എന്നിവയ്‌ക്കായുള്ള ഞങ്ങളുടെ പോസിറ്റീവ് സ്റ്റെയിനിംഗ്, Specc11 മ്യൂട്ടന്റ് ഭ്രൂണങ്ങളുടെ തുറന്ന ന്യൂറൽ ഫോൾഡുകളിൽ യഥാർത്ഥത്തിൽ CNCC അടങ്ങിയിട്ടുണ്ടെന്ന് സ്ഥിരീകരിച്ചു.കൂടാതെ, AP2A, SOX10 എന്നിവ നേരത്തെയുള്ള മൈഗ്രേറ്റിംഗ് എൻസിസിയുടെ മാർക്കറുകൾ ആയതിനാൽ, പോസിറ്റീവ് സ്റ്റെയിനിംഗ് സൂചിപ്പിക്കുന്നത്, ഈ സെല്ലുകൾ പോസ്റ്റ്-മൈഗ്രേറ്ററി CNCC ആണെന്ന്, അത് E9.5 കൊണ്ട് തരംതിരിക്കാൻ കഴിയില്ല.
SPECC1L-ന്റെ AJ-യുടെ തന്മാത്രാ നിയന്ത്രണം PI3K-AKT സിഗ്നലിംഗ് വഴി മധ്യസ്ഥതയിലാണെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.SPECC1L കുറവുള്ള കോശങ്ങളിലും ടിഷ്യൂകളിലും AKT സിഗ്നലിംഗ് കുറയുന്നു.Fantauzzo മറ്റുള്ളവരുടെ കണ്ടെത്തലുകൾ.ക്രാനിയോഫേഷ്യൽ മോർഫോജെനിസിസിൽ PI3K-AKT സിഗ്നലിംഗിനുള്ള നേരിട്ടുള്ള പങ്ക് പിന്തുണയ്ക്കുന്നു.(2014) PDGFRα-അധിഷ്ഠിത PI3K-AKT സിഗ്നലിംഗ് സജീവമാക്കുന്നതിന്റെ അഭാവം ഒരു പിളർപ്പ് അണ്ണാക്ക് ഫിനോടൈപ്പിലേക്ക് നയിക്കുന്നു.U2OS സെല്ലുകളിൽ AJ, സെൽ ആകൃതി എന്നിവ മാറ്റാൻ PI3K-AKT പാതയുടെ തടസ്സം മതിയാകുമെന്നും ഞങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു.ഞങ്ങളുടെ കണ്ടെത്തലുകൾക്ക് അനുസൃതമായി, കെയ്ൻ et al.എൻഡോതെലിയൽ സെല്ലുകളിലെ PI3K α110 ഉപയൂണിറ്റിന്റെ നിയന്ത്രണം കുറയ്ക്കുന്നത് പെരിസെല്ലുലാർ β-കാറ്റെനിൻ സ്റ്റെയിനിംഗിൽ സമാനമായ വർദ്ധനവിന് കാരണമാകുമെന്ന് 37 കാണിച്ചു, ഇത് "കണക്റ്റിവിറ്റി ഇൻഡക്‌സിന്റെ" വർദ്ധനവ് എന്നറിയപ്പെടുന്നു.എന്നിരുന്നാലും, എൻഡോതെലിയൽ സെല്ലുകളിൽ, ആക്റ്റിൻ ഫിലമെന്റുകൾ ഇതിനകം തന്നെ വളരെ ക്രമീകരിച്ചിരിക്കുന്നു, PI3K-AKT പാതയെ അടിച്ചമർത്തുന്നത് ഒരു അയഞ്ഞ സെൽ ആകൃതിയിൽ കലാശിക്കുന്നു.വിപരീതമായി, SPECC1L-kd U2OS സെല്ലുകൾ നീളമേറിയ സെൽ ആകൃതി കാണിച്ചു.ഈ വ്യത്യാസം സെൽ തരം നിർദ്ദിഷ്ടമായിരിക്കാം.PI3K-AKT സിഗ്നലിംഗ് അടിച്ചമർത്തുന്നത് ആക്ടിൻ സൈറ്റോസ്‌കെലിറ്റണിനെ ശാശ്വതമായി ബാധിക്കുമ്പോൾ, സെൻട്രൽ ആക്റ്റിൻ ഫൈബറുകളുടെ സാന്ദ്രതയിലും ഓർഗനൈസേഷനിലുമുള്ള മാറ്റങ്ങൾ മൂലമുണ്ടാകുന്ന പിരിമുറുക്കത്തിലെ മാറ്റങ്ങളാണ് സെൽ ആകൃതിയിലുള്ള പ്രഭാവം നിർണ്ണയിക്കുന്നത്.U2OS സെല്ലുകളിൽ, SPECC1L- കുറവുള്ള AJ മാറ്റത്തിന്റെയും വീണ്ടെടുക്കലിന്റെയും അടയാളമായി ഞങ്ങൾ സെൽ ആകൃതി മാറ്റങ്ങൾ മാത്രമേ ഉപയോഗിച്ചിട്ടുള്ളൂ.ഉപസംഹാരമായി, SPECC1L അപര്യാപ്തതയിൽ AKT പാതയുടെ തടസ്സം AJ സ്ഥിരത വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും CNCC-യിൽ ഡീലാമിനേഷൻ കുറയ്ക്കുകയും ചെയ്യുമെന്ന് ഞങ്ങൾ അനുമാനിക്കുന്നു.
രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, SPECC1L-ന്റെ അഭാവത്തിൽ ഫോസ്‌ഫോറിലേറ്റഡ് 473-AKT ലെവലുകൾക്ക് പുറമേ വിട്രോയിലും വിവോയിലും പാൻ-എകെടി ലെവലുകൾ കുറച്ചു, ഇത് എകെടി പ്രോട്ടീൻ സ്ഥിരത അല്ലെങ്കിൽ വിറ്റുവരവിന്റെ തലത്തിൽ PI3K-AKT സിഗ്നലിംഗ് നിയന്ത്രിക്കാൻ നിർദ്ദേശിക്കുന്നു.Opitz/GBBB സിൻഡ്രോമുമായി ബന്ധപ്പെട്ട SPECC1L, MID1 ജീനുകൾ, മൈക്രോട്യൂബുളുകൾ 18,22 സ്ഥിരപ്പെടുത്തുന്ന പ്രോട്ടീനുകളെ എൻകോഡ് ചെയ്യുന്നു.SPECC1L, MID1 എന്നിവ മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ സ്റ്റെബിലൈസേഷനെ മധ്യസ്ഥമാക്കുന്ന സംവിധാനം പൂർണ്ണമായി മനസ്സിലായിട്ടില്ല.SPECC1L-ന്റെ കാര്യത്തിൽ, ഈ സ്ഥിരതയിൽ മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾസ് 18-ന്റെ ഒരു ഉപവിഭാഗത്തിന്റെ മെച്ചപ്പെടുത്തിയ അസറ്റിലേഷൻ ഉൾപ്പെടുന്നു.AKT പോലെയുള്ള മറ്റ് പ്രോട്ടീനുകളെ സ്ഥിരപ്പെടുത്തുന്നതിന് SPECC1L സമാനമായ ഒരു സംവിധാനം ഉപയോഗിച്ചേക്കാം.എകെടി പ്രോട്ടീനിലെ ലൈസിൻ അവശിഷ്ടങ്ങളുടെ അസറ്റിലേഷൻ മെംബ്രൺ ലോക്കലൈസേഷനും ഫോസ്ഫോറിലേഷനും കുറയുന്നതിലേക്ക് നയിക്കുന്നു.കൂടാതെ, AKT-യിലെ അതേ ലൈസിൻ അവശിഷ്ടത്തിൽ K63 ശൃംഖലയുടെ സർവ്വവ്യാപിത്വം അതിന്റെ മെംബ്രൺ പ്രാദേശികവൽക്കരണത്തിനും സജീവമാക്കലിനും ആവശ്യമാണ്39,40.വിവിധ ഹൈ ത്രൂപുട്ട് യീസ്റ്റ് രണ്ട്-ഹൈബ്രിഡ് സ്ക്രീനുകളിൽ തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുള്ള SPECC1L പ്രോട്ടീനുകളുമായി ഇടപഴകുന്ന നിരവധി ഘടകങ്ങളിൽ, നാല് - CCDC841, ECM2942, APC, UBE2I43 - പ്രോട്ടീൻ വിറ്റുവരവ് അല്ലെങ്കിൽ സർവ്വവ്യാപനം അല്ലെങ്കിൽ സുമൊയിലേഷൻ വഴി സ്ഥിരത എന്നിവയിൽ ഉൾപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്.AKT ലെസിൻ അവശിഷ്ടങ്ങളുടെ വിവർത്തനാനന്തര പരിഷ്ക്കരണത്തിൽ SPECC1L ഉൾപ്പെട്ടേക്കാം, ഇത് AKT സ്ഥിരതയെ ബാധിക്കുന്നു.എന്നിരുന്നാലും, എകെടി പ്രോട്ടീന്റെ പ്രാദേശികവൽക്കരണത്തിലും സ്ഥിരതയിലും SPECC1L ന്റെ നിർണായക പങ്ക് വ്യക്തമാക്കേണ്ടതുണ്ട്.
വിവോയിലെ SPECC1L എക്‌സ്‌പ്രഷനിലെ ഗുരുതരമായ വൈകല്യങ്ങളുടെ ഫലമായി എജെ മാർക്കർ സ്റ്റെയിനിംഗും വികലമായ CNCC ഓവർലേയും വർദ്ധിച്ചു, അപ്പോപ്റ്റോസിസും ആദ്യകാല ഭ്രൂണ മാരകതയും വർദ്ധിച്ചു.അപ്പോപ്റ്റോസിസിന്റെ വർദ്ധിച്ച അളവിലുള്ള മൗസ് മ്യൂട്ടന്റുകൾക്ക് ന്യൂറൽ ട്യൂബ് വൈകല്യങ്ങൾ 44,45,46,47, ക്രാനിയോഫേഷ്യൽ വൈകല്യങ്ങൾ എന്നിവയുമായി ബന്ധമുണ്ടെന്ന് മുൻ റിപ്പോർട്ടുകൾ കാണിക്കുന്നു.ന്യൂറൽ ഫോൾഡുകളിലോ തൊണ്ടയിലെ കമാനങ്ങളിലോ ഉള്ള അമിതമായ കോശ മരണം ശരിയായ മോർഫോജെനെറ്റിക് ചലനത്തിന് ആവശ്യമായ കോശങ്ങളുടെ അപര്യാപ്തതയ്ക്ക് കാരണമാകുമെന്ന് അഭിപ്രായമുണ്ട് 48,49,50.നേരെമറിച്ച്, ഞങ്ങളുടെ SPECC1L കുറവുള്ള സെൽ ലൈനുകൾ, മിതമായ കുറച്ച SPECC1L എക്സ്പ്രഷൻ, വർദ്ധിച്ച സെൽ ഡെത്ത് തെളിവുകളില്ലാതെ AJ മാറ്റങ്ങൾ മാത്രം കാണിക്കുന്നു.എന്നിരുന്നാലും, ഈ കെഡി സെല്ലുകളിലെ PI3K-AKT പാത്ത്‌വേയുടെ കെമിക്കൽ ഇൻഹിബിഷൻ അപ്പോപ്റ്റോസിസിന്റെ വർദ്ധനവിന് കാരണമായി.അങ്ങനെ, SPECC1L എക്സ്പ്രഷനിലോ ഫംഗ്ഷനിലോ മിതമായ കുറവ് കോശങ്ങളുടെ നിലനിൽപ്പ് ഉറപ്പാക്കുന്നു.സെന്റ്.E9.5—ഒരുപക്ഷേ, ജീൻ ക്യാപ്‌ചർ കാര്യക്ഷമത കുറയുന്നതിനാൽ—അവരുടെ ന്യൂറൽ ട്യൂബുകൾ അടയ്‌ക്കാനും പിന്നീട് വികസനത്തിൽ നിർത്താനും കഴിയും, പലപ്പോഴും ക്രാനിയോഫേഷ്യൽ വൈകല്യങ്ങൾ (ചിത്രം S3).ക്രാനിയോഫേഷ്യൽ അസാധാരണത്വങ്ങളുള്ള ഹെറ്ററോസൈഗസ് സ്പെക്1എൽ ഭ്രൂണങ്ങളുടെ അപൂർവ സംഭവങ്ങളും ഇതുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു-ഒരുപക്ഷേ വർദ്ധിച്ച ജീൻ ക്യാപ്‌ചർ കാര്യക്ഷമത മൂലമാകാം-അതുപോലെ തന്നെ സീബ്രാഫിഷിലെ കണ്ടെത്തലും രണ്ട് SPECC1L ഓർത്തോലോഗുകളിലൊന്ന് (specc1lb) വൈകി ഭ്രൂണ നഷ്ടം ഉൾപ്പെടെയുള്ള ഭ്രൂണ നഷ്ടത്തിന് കാരണമാകുന്നു. താഴത്തെ താടിയെല്ലുകളും ഉഭയകക്ഷി പിളർപ്പുകളും51.അങ്ങനെ, മനുഷ്യ രോഗികളിൽ തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുള്ള ഭിന്നശേഷിയുള്ള SPECC1L പ്രവർത്തനരഹിതമായ മ്യൂട്ടേഷനുകൾ, ക്രാനിയോഫേഷ്യൽ മോർഫോജെനിസിസ് സമയത്ത് SPECC1L ഫംഗ്ഷനിൽ ചെറിയ വൈകല്യങ്ങൾക്ക് കാരണമായേക്കാം, ഇത് അവരുടെ ഓറോഫേഷ്യൽ പിളർപ്പുകളെ വിശദീകരിക്കാൻ പര്യാപ്തമാണ്.SPECC1L-അടിസ്ഥാനത്തിലുള്ള ഇന്റർസെല്ലുലാർ കോൺടാക്റ്റുകളുടെ നിയന്ത്രണവും പാലറ്റോജെനിസിസിലും തൊണ്ടയിലെ കമാനങ്ങളുടെ സംയോജനത്തിലും ഒരു പങ്കുവഹിച്ചേക്കാം.SPECC1L ഫംഗ്‌ഷനെക്കുറിച്ചുള്ള കൂടുതൽ പഠനങ്ങൾ, ന്യൂറോപിത്തീലിയൽ സെൽ മോട്ടിലിറ്റിയിലും ക്രാനിയോഫേഷ്യൽ മോർഫോജെനിസിസിലും ന്യൂറൽ ട്യൂബ് അടയ്ക്കുമ്പോൾ CNCC-യിലെ താൽക്കാലിക ഇന്റർസെല്ലുലാർ കോൺടാക്‌റ്റുകളുടെ പങ്ക് വ്യക്തമാക്കാൻ സഹായിക്കും.
U2OS ഓസ്റ്റിയോസർകോമ നിയന്ത്രണവും SPECC1L-kd സെല്ലുകളും മുമ്പ് വിവരിച്ചിട്ടുണ്ട് (Saadi et al., 2011).SPECC1L-നെതിരെയുള്ള ആൻറിബോഡികളും മുമ്പ് സ്വഭാവ സവിശേഷതയാണ് (സാദി et al., 2011).ആന്റി-β-കാറ്റെനിൻ ആന്റിബോഡികൾ (മുയൽ; 1:1000; സാന്താക്രൂസ്, ഡാളസ്, TX) (മൗസ്; 1:1000; സെൽ സിഗ്നലിംഗ് ടെക്നോളജി, ഡാൻവേഴ്സ്, എംഎ), മയോസിൻ IIb (1:1000; സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്, സെന്റ് ലൂയിസ് ) , MO) ), ഇ-കാഥറിൻ (1:1000; അബ്കാം, കേംബ്രിഡ്ജ്, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , കാലിഫോർണിയ), DLX2 (1:1000; Abcam, കേംബ്രിഡ്ജ്, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; സെൽ സിഗ്നലിംഗ് ടെക്നോളജി, ഡാൻവേഴ്സ്, എംഎ), പാൻ-എകെടി (1:1000; തെർമോഫിഷർ സയന്റിഫിക്, വാൽതം ) , KI67 (1:1000; സെൽ സിഗ്നലിംഗ് ടെക്നോളജി, ഡാൻവേഴ്സ്, എംഎ), ക്ലീവ്ഡ് കാസ്പേസ് 3 (1:1000; സെൽ സിഗ്നലിംഗ് ടെക്നോളജി, ഡാൻവേഴ്സ്, എംഎ) കൂടാതെ β-ആക്ടിൻ (1:2500; സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്, സെന്റ്. MO) വിവരിച്ചതുപോലെ ഉപയോഗിച്ചു..ആക്ടിൻ ഫിലമെന്റുകൾ ആക്ടി-സ്റ്റെയിൻ റോഡാമൈൻ ഫാലോയ്ഡിൻ (സൈറ്റോസ്‌കെലിറ്റൺ, ഡെൻവർ, കൊളറാഡോ) ഉപയോഗിച്ച് കറപിടിച്ചു.
U2OS കൺട്രോൾ സെല്ലുകളും SPECC1L-kd സെല്ലുകളും 10% ഗര്ഭപിണ്ഡത്തിന്റെ ബോവിന് സെറം (ലൈഫ് ടെക്നോളജീസ്, കാള്സ്ബാഡ്, CA) സപ്ലിമെന്റ് ചെയ്ത സ്റ്റാന്ഡേര്ഡ് ഹൈ ഗ്ലൂക്കോസ് DMEM-ല് സംസ്ക്കരിച്ചു.AJ മാറ്റങ്ങൾക്കായി, 2 x 105 സെല്ലുകൾ 0.1% പോർസിൻ ജെലാറ്റിൻ (സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്, സെന്റ് ലൂയിസ്, MO) ഉപയോഗിച്ച് ഗ്ലാസിൽ വിത്ത് വിതറി, കോശത്തിന്റെ ആകൃതിയിലുള്ള മാറ്റങ്ങൾ നിരീക്ഷിക്കുന്നു.വ്യത്യസ്‌ത സൂചിപ്പിച്ച സമയ പോയിന്റുകളിൽ സെല്ലുകൾ ശേഖരിച്ചു: വിതച്ച് 4 മണിക്കൂർ കഴിഞ്ഞ് (t = 1), വിത്ത് വിതച്ച് 24 മണിക്കൂർ കഴിഞ്ഞ് (t = 2), കോശത്തിന്റെ ആകൃതിയിൽ മാറ്റമില്ലാത്ത സംഗമം (t = 3), സെൽ ആകൃതിയിലെ മാറ്റം (t = 4) , സെൽ ആകൃതി മാറ്റത്തിന് ശേഷം 24 മണിക്കൂറും (t = 5) 48 മണിക്കൂറും സെൽ ആകൃതി മാറ്റത്തിന് ശേഷം (t = 6) (ചിത്രം 1, 2, 3).PI3K-AKT പാത്ത്‌വേ മോഡുലേറ്റ് ചെയ്യുന്നതിന്, PI3K-AKT ഇൻഹിബിറ്റർ വോർട്ട്‌മാനിൻ (TOCRIS ബയോസയൻസസ്, മിനിയാപൊളിസ്, മിനസോട്ട) അല്ലെങ്കിൽ SC-79 ആക്‌റ്റിവേറ്റർ (TOCRIS ബയോസയൻസസ്, മിനിയാപൊളിസ് ആഡംസ്) ഉപയോഗിച്ച് സൂചിപ്പിച്ച സാന്ദ്രതയിൽ സെല്ലുകൾ സംസ്‌കരിക്കപ്പെട്ടു.രാസവസ്തുക്കൾ അടങ്ങിയ മാധ്യമം ദിവസവും മാറ്റി.
സാധാരണ കൾച്ചർ സാഹചര്യങ്ങളിൽ തത്സമയ നിയന്ത്രണത്തിലും കെഡി സെല്ലുകളിലും ഫ്രെയിം-ബൈ-ഫ്രെയിം റെക്കോർഡിംഗുകൾ ഉണ്ടാക്കി, ഓരോ 10 മിനിറ്റിലും 7 ദിവസത്തേക്ക് ഘട്ടം കോൺട്രാസ്റ്റ് ചിത്രങ്ങൾ ശേഖരിക്കുന്നു.കമ്പ്യൂട്ടർ നിയന്ത്രിത Leica DM IRB ഇൻവെർട്ടഡ് മൈക്രോസ്കോപ്പും മെക്കാനിക്കൽ സ്റ്റേജും ഉപയോഗിച്ച് ഒരു QImaging Retiga-SRV ക്യാമറയുമായി ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന 10 × N-PLAN ഒബ്ജക്റ്റീവും ഉപയോഗിച്ചാണ് ചിത്രങ്ങൾ നേടിയത്.ഇമേജിംഗ് സമയത്ത്, 5% CO2 ഉള്ള ഈർപ്പമുള്ള അന്തരീക്ഷത്തിൽ സെൽ കൾച്ചറുകൾ 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ നിലനിർത്തി.
Regional Mutant Mouse Resource Center (UC Davis, CA) ൽ നിന്നുള്ള DTM096, RRH048 എന്നീ രണ്ട് ജീൻ ട്രാപ്പ് ES സെൽ ലൈനുകൾ Specc11lgtDTM096, Specc1lgtRRH046 എന്നീ നിയുക്ത മൗസ് ലൈനുകൾ സൃഷ്ടിക്കാൻ ഉപയോഗിച്ചു.ചുരുക്കത്തിൽ, 129/REJ ES സെല്ലുകൾ C57BL6 ബ്ലാസ്റ്റോസിസ്റ്റുകളിലേക്ക് കുത്തിവച്ചു.തത്ഫലമായുണ്ടാകുന്ന ചിമെറിക് ആൺ എലികളെ പെൺ C57BL6 എലികൾ ഉപയോഗിച്ച് വളർത്തി, അഗൂട്ടി കോട്ട് നിറമുള്ള സന്തതികളെ തിരിച്ചറിയാൻ.ഹെറ്ററോസൈഗോട്ടുകളെ തിരിച്ചറിയാൻ ജീൻ ട്രാപ്പ് വെക്റ്റർ ഇൻസെർട്ടുകളുടെ സാന്നിധ്യം ഉപയോഗിച്ചു.129/REJ;C57BL6 എന്ന മിശ്രിത പശ്ചാത്തലത്തിലാണ് എലികളെ സൂക്ഷിച്ചിരുന്നത്.ജനിതക ട്രാപ്പ് വെക്റ്ററിന്റെ ഉൾപ്പെടുത്തൽ സൈറ്റിന്റെ സ്ഥാനം RT-PCR, ജീനോം സീക്വൻസിങ്, ജനിതക പൂർത്തീകരണം എന്നിവയിലൂടെ സ്ഥിരീകരിച്ചു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 1).ഇരട്ട ഹെറ്ററോസൈഗസ് Specc1lGT എലികളുടെ CNCC വംശപരമ്പര കണ്ടെത്താൻ, ROSAmTmG, Wnt1-Cre all munt1-Cre എന്നിവ നിർമ്മിക്കാൻ ROSAmTmG (#007576), Wnt1-Cre (#003829) എലികൾ (ജാക്‌സൺ ലബോറട്ടറി, ബാർ ഹാർബർ, ME) എന്നിവ കടന്നുപോയി.യൂണിവേഴ്സിറ്റി ഓഫ് കൻസാസ് മെഡിക്കൽ സെന്ററിന്റെ ഇൻസ്റ്റിറ്റ്യൂഷണൽ അനിമൽ കെയർ ആൻഡ് യൂസ് കമ്മിറ്റി അംഗീകരിച്ച പ്രോട്ടോക്കോളുകൾ അനുസരിച്ചാണ് എലികളിലെ എല്ലാ പരീക്ഷണങ്ങളും നടത്തിയത്.
ഊഷ്മാവിൽ 60 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് ഭ്രൂണങ്ങൾ (1% ഫോർമാൽഡിഹൈഡ്, 0.2% ഗ്ലൂട്ടറാൾഡിഹൈഡ്, 2 എംഎം എംജിസിഎൽ2, 0.02% എൻപി-40, 5 എംഎം ഇജിടിഎ) ഉറപ്പിച്ചു.എക്സ്-ഗാൽ സ്റ്റെയിനിംഗ് ലായനിയിൽ ഉറപ്പിച്ചതിന് ശേഷം (5 എംഎം പൊട്ടാസ്യം ഫെറിക്യാനൈഡ്, 5 എംഎം പൊട്ടാസ്യം ഫെറോസയനൈഡ്, 2 എംഎം എംജിസിഎൽ2, 0.01% സോഡിയം ഡിയോക്സികോളേറ്റ്, 0.02% എൻപി-40, 1 മില്ലിഗ്രാം / മില്ലി എക്സ്-ഗാൽ) സ്റ്റെയിൻ വികസനം 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ നടത്തി. .1-6 മണിക്കൂറിനുള്ളിൽ °C.ഭ്രൂണങ്ങൾ 4% പിഎഫ്എയിൽ പോസ്റ്റ് ഫിക്സഡ് ചെയ്യുകയും ദൃശ്യവൽക്കരിക്കുകയും ചെയ്തു.
വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ടിംഗിനായി, HALT പ്രോട്ടീസ് ഇൻഹിബിറ്ററുകളുടെ (സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്, സെന്റ്. ലൂയിസ്, MO) ഒരു മിശ്രിതം സപ്ലിമെന്റ് ചെയ്ത നിഷ്ക്രിയ ലിസിസ് ബഫറിൽ (പ്രൊമേഗ, ഫിച്ച്ബർഗ്, WI) കോശങ്ങൾ ലൈസ് ചെയ്തു.12% പോളിഅക്രിലാമൈഡ് മിനി-പ്രോട്ടീൻ ടിജിഎക്സ് റെഡിമെയ്ഡ് ജെല്ലുകളിൽ (ബയോ-റാഡ്, ഹെർക്കുലീസ്, സിഎ) ലൈസറ്റുകൾ പ്രോസസ്സ് ചെയ്യുകയും ഇമ്മോബിലോൺ പിവിഡിഎഫ് മെംബ്രണുകളിലേക്ക് (ഇഎംഡി മില്ലിപോർ, ബില്ലെറിക്ക, എംഎ) മാറ്റുകയും ചെയ്തു.0.1% ട്വീൻ അടങ്ങിയ പിബിഎസിലെ 5% പാലിൽ ചർമ്മം തടഞ്ഞു.ആന്റിബോഡികൾ ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് 4 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ അല്ലെങ്കിൽ ഒരു മണിക്കൂർ ഊഷ്മാവിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു.സിഗ്നൽ ഉൽപ്പാദനത്തിനായി ഫെംറ്റോ സൂപ്പർ സിഗ്നൽ വെസ്റ്റ് ഇസിഎൽ റീജന്റ് (തെർമോ സയന്റിഫിക്, വാൽതം, എംഎ) ഉപയോഗിച്ചു.ഇമ്മ്യൂണോസ്റ്റൈനിംഗിനായി, ഭ്രൂണങ്ങൾ ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് 4% PFA/PBS-ൽ ഉറപ്പിക്കുകയും ക്രയോപ്രെസർവ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.1% സാധാരണ ആട് സെറം (തെർമോ സയന്റിഫിക്, വാൽതം, എംഎ), 0.1% ട്രൈറ്റൺ X-100 (സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്, സെന്റ്. ലൂയിസ്, MO) എന്നിവ അടങ്ങിയ പിബിഎസിൽ ടിഷ്യു ക്രയോസെക്ഷനുകൾ തടഞ്ഞു, തുടർന്ന് ഇൻകുബേറ്ററിൽ 4 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. രാത്രി.ആന്റി-ആന്റിബോഡിയും ഫ്ലൂറസെന്റ് സെക്കൻഡറി ആന്റിബോഡിയും (1:1000) 1 മണിക്കൂർ 4 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ.സ്റ്റെയിൻഡ് സെക്ഷനുകൾ പ്രോലോംഗ് ഗോൾഡ് മീഡിയത്തിൽ (തെർമോ സയന്റിഫിക്, വാൽതം എംഎ) സ്ഥാപിക്കുകയും ലെയ്ക ടിസിഎസ് എസ്പിഇ കൺഫോക്കൽ മൈക്രോസ്കോപ്പ് ഉപയോഗിച്ച് ഫ്ലാറ്റ് ഇമേജുകൾ നേടുകയും ചെയ്തു.ഓരോ ഇമ്മ്യൂണോസ്റ്റൈനിംഗും കുറഞ്ഞത് രണ്ട് മ്യൂട്ടന്റ് ഭ്രൂണങ്ങളുടെ സിറോസെക്ഷനുകളിൽ മൂന്ന് സ്വതന്ത്ര പരീക്ഷണങ്ങളായി നടത്തി.ഒരു പ്രതിനിധി പരീക്ഷണം കാണിക്കുന്നു.
പരിഷ്കരിച്ച RIPA ബഫറിൽ (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% ഗ്ലിസറോൾ, 2 mM EDTA, HALT പ്രോട്ടീസ് ഇൻഹിബിറ്റർ (സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്, സെന്റ്. ലൂയിസ്) എന്നിവയിൽ സെല്ലുകൾ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. ചുരുക്കത്തിൽ, ലൈസെറ്റുകൾ പ്രോട്ടീൻ ജി മാഗ്നറ്റിക് ബീഡുകൾ (ലൈഫ് ടെക്നോളജീസ്, കാൾസ്ബാഡ്, സിഎ) ഉപയോഗിച്ച് മുൻകൂട്ടി ശുദ്ധീകരിക്കുകയും തുടർന്ന് 4 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും SPECC1L അല്ലെങ്കിൽ IgG പ്രോട്ടീൻ G പ്രോട്ടീൻ ബീഡുകൾ ഉപയോഗിച്ച് SPECC1L വേർതിരിച്ചെടുക്കുകയും ആന്റി ഉപയോഗിച്ച് വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ടിംഗ് നടത്തുകയും ചെയ്തു. മുകളിൽ വിവരിച്ച -β-catenin ആന്റിബോഡി കാണിച്ചിരിക്കുന്ന കോ-ഐപി പരീക്ഷണങ്ങൾ നാല് സ്വതന്ത്ര പരീക്ഷണങ്ങളുടെ പ്രതിനിധികളാണ്.
യൂണിവേഴ്സിറ്റി ഓഫ് കൻസാസ് മെഡിക്കൽ സെന്ററിലെ ഇലക്ട്രോൺ മൈക്രോസ്കോപ്പി സെന്ററിലേക്ക് ഫിക്സഡ് കൾച്ചർഡ് സെല്ലുകൾ അല്ലെങ്കിൽ മൗസ് ഭ്രൂണ കലകൾ നൽകി.ചുരുക്കത്തിൽ, സാമ്പിളുകൾ EMbed 812 റെസിനിൽ (ഇലക്ട്രോൺ മൈക്രോസ്കോപ്പി സയൻസസ്, ഫോർട്ട് വാഷിംഗ്ടൺ, PA) ഉൾച്ചേർത്തു, 60 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് പോളിമറൈസ് ചെയ്തു, കൂടാതെ ഒരു ഡയമണ്ട് ബ്ലേഡ് ഘടിപ്പിച്ച Leica UC7 അൾട്രാമൈക്രോടോം ഉപയോഗിച്ച് 80 nm-ൽ വിഭജിച്ചിരിക്കുന്നു.100 kV Lab6 തോക്ക് ഘടിപ്പിച്ച JEOL JEM-1400 ട്രാൻസ്മിഷൻ ഇലക്‌ട്രോൺ മൈക്രോസ്‌കോപ്പ് ഉപയോഗിച്ച് വിഭാഗങ്ങൾ ദൃശ്യവൽക്കരിച്ചു.
ഈ ലേഖനം എങ്ങനെ ഉദ്ധരിക്കാം: Wilson, NR et al.SPECC1L ന്റെ കുറവ് പിളർന്ന സന്ധികളുടെ സ്ഥിരത വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിനും തലയോട്ടിയിലെ ന്യൂറൽ ക്രെസ്റ്റ് സെല്ലുകളുടെ ഡിലാമിനേഷൻ കുറയ്ക്കുന്നതിനും ഇടയാക്കുന്നു.ശാസ്ത്രം.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
സെന്റ്-ജീൻ, ജെ.-പി.ന്യൂറൽ ക്രെസ്റ്റിന്റെ ഇൻഡക്ഷനും വ്യത്യാസവും.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
കോർഡെറോ, DR et al.ചലനത്തിലുള്ള ക്രാനിയൽ ന്യൂറൽ ക്രെസ്റ്റ് സെല്ലുകൾ: ക്രാനിയോഫേഷ്യൽ വികസനത്തിൽ അവയുടെ പങ്ക്.അമേരിക്കൻ ജേണൽ ഓഫ് മെഡിക്കൽ ജനറ്റിക്സ്.ഭാഗം A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
ബോലാൻഡ്, ആർപി ന്യൂറോക്രിസ്റ്റോപതിയ: 20 വർഷത്തിലേറെയായി അതിന്റെ വളർച്ചയും വികാസവും.ശിശുരോഗവിദഗ്ദ്ധൻ.പതോളജി.ലബോറട്ടറി.മരുന്ന്.17, 1–25 (1997).
മംഗോൾഡ് ഇ., ലുഡ്‌വിഗ് കെ.യു, നോട്ടൻ എം.എം.മോളിക്യുലർ മെഡിസിനിലെ ട്രെൻഡുകൾ 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
മിനു, എം., റിലേ, ക്രാനിയോഫേഷ്യൽ ഡെവലപ്‌മെന്റ് സമയത്ത് ക്രാനിയൽ ന്യൂറൽ ക്രെസ്റ്റ് സെൽ മൈഗ്രേഷന്റെയും പാറ്റേണിംഗിന്റെയും എഫ്എം മോളിക്യുലാർ മെക്കാനിസങ്ങൾ.വികസനം 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
ഡിക്‌സൺ, എംജെ, മരാസിറ്റ, എംഎൽ, ബീറ്റി, ടിഎച്ച്, മുറേ, ജെകെ വിള്ളൽ ചുണ്ടും അണ്ണാക്കും: ജനിതക, പാരിസ്ഥിതിക സ്വാധീനങ്ങൾ മനസ്സിലാക്കൽ.സ്വാഭാവിക അഭിപ്രായം.ജനിതകശാസ്ത്രം 12, 167-178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
ഇൻഗ്രാം, CR et al.ഇന്റർഫെറോൺ-റെഗുലേറ്റിംഗ് ഫാക്ടർ-6 (Irf6)-അപര്യാപ്തമായ എലികളിലെ ചർമ്മം, കൈകാലുകൾ, ക്രാനിയോഫേഷ്യൽ മേഖല എന്നിവയുടെ അസാധാരണമായ മോർഫോജെനിസിസ്.ദേശീയ ജനെറ്റ്.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
പെയാർഡ്-ജാൻവിഡ്, എം. തുടങ്ങിയവർ.GRHL3-ലെ പ്രബലമായ മ്യൂട്ടേഷനുകൾ വാൻ ഡെർ വാർഡ് സിൻഡ്രോമിന് കാരണമാകുകയും ഓറൽ പെരിഡെർമിന്റെ വളർച്ചയെ തടസ്സപ്പെടുത്തുകയും ചെയ്യുന്നു.ആം ജെ ഹം ജെനെറ്റ് 94, 23–32, ഡോയി: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
ഹാരിസ്, എംജെ, ജൂറിലോഫ്, ഡിഎം എന്നിവർ ന്യൂറൽ ട്യൂബ് ക്ലോഷറിലെ വൈകല്യങ്ങളുള്ള മൗസ് മ്യൂട്ടന്റുകളുടെ ലിസ്റ്റ് അപ്‌ഡേറ്റ് ചെയ്യുകയും ന്യൂറൽ ട്യൂബ് ക്ലോഷറിനെക്കുറിച്ചുള്ള പൂർണ്ണമായ ജനിതക ധാരണയിലേക്ക് പുരോഗമിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.ജനന വൈകല്യങ്ങളുടെ അന്വേഷണം.പാർട്ട് എ, ക്ലിനിക്കൽ ആൻഡ് മോളിക്യുലാർ ടെററ്റോളജി 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-മെഡിയേറ്റഡ് PDGFRalpha സിഗ്നലിംഗ്, p53-ആശ്രിത ഇൻട്രാ സെല്ലുലാർ പാത്ത്‌വേയിലൂടെ അസ്ഥികൂട വികസനത്തിലെ അതിജീവനത്തെയും വ്യാപനത്തെയും നിയന്ത്രിക്കുന്നു.ജീൻ വികസനം 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
കോപ്പ്, എജെ, ഗ്രീൻ, എൻഡി, മർഡോക്ക്, ജെഎൻ ഡിഷെവെൽഡ്: ന്യൂറൽ ട്യൂബ് ക്ലോഷറിലേക്കുള്ള സംയോജിത വികാസത്തിന്റെ ബന്ധം.ന്യൂറോളജിയിലെ ട്രെൻഡുകൾ.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).