347 സ്റ്റെയിൻലെസ്സ് സ്റ്റീൽ കോയിൽഡ് ട്യൂബിംഗ് കെമിക്കൽ ഘടകം, ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി (CLMS) ഉപയോഗിച്ച് നോവൽ ഇന്റർഫെറോൺ-റെസ്പോൺസീവ് ഹ്യൂമൻ ല്യൂക്കോസൈറ്റ് ആന്റിജൻ-എ (HLA-A) ചാപ്പറോൺ പ്രോട്ടീനുകളുടെ തിരിച്ചറിയൽ

Nature.com സന്ദർശിച്ചതിന് നന്ദി.പരിമിതമായ CSS പിന്തുണയുള്ള ഒരു ബ്രൗസർ പതിപ്പാണ് നിങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്നത്.മികച്ച അനുഭവത്തിനായി, നിങ്ങൾ ഒരു അപ്‌ഡേറ്റ് ചെയ്‌ത ബ്രൗസർ ഉപയോഗിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു (അല്ലെങ്കിൽ Internet Explorer-ൽ അനുയോജ്യത മോഡ് പ്രവർത്തനരഹിതമാക്കുക).കൂടാതെ, നിലവിലുള്ള പിന്തുണ ഉറപ്പാക്കാൻ, ഞങ്ങൾ ശൈലികളും JavaScript ഇല്ലാതെ സൈറ്റ് കാണിക്കുന്നു.
ഓരോ സ്ലൈഡിലും മൂന്ന് ലേഖനങ്ങൾ കാണിക്കുന്ന സ്ലൈഡറുകൾ.സ്ലൈഡുകളിലൂടെ നീങ്ങാൻ ബാക്ക്, അടുത്ത ബട്ടണുകൾ ഉപയോഗിക്കുക അല്ലെങ്കിൽ ഓരോ സ്ലൈഡിലൂടെയും നീങ്ങാൻ അവസാനത്തെ സ്ലൈഡ് കൺട്രോളർ ബട്ടണുകൾ ഉപയോഗിക്കുക.

ഉൽപ്പന്ന വിവരണം

സ്റ്റെയിൻലെസ്സ് സ്റ്റീൽ 347L കോയിൽ ട്യൂബുകൾ, സ്റ്റീൽ ഗ്രേഡ്: SS347L

ഇന്റർഫെറോൺ സിഗ്നലിംഗ് സിസ്റ്റം പരിസ്ഥിതിയിൽ നിന്നുള്ള രോഗകാരിയും അന്തർലീനവുമായ പാത്തോളജിക്കൽ സിഗ്നലുകളുടെ വിശാലമായ ശ്രേണികളോട് ശക്തമായ സൈറ്റോകൈൻ പ്രതികരണത്തെ പ്രേരിപ്പിക്കുന്നു, ഇത് ഇന്റർഫെറോൺ-ഇൻഡ്യൂസിബിൾ പ്രോട്ടീനുകളുടെ ഉപവിഭാഗങ്ങളെ പ്രേരിപ്പിക്കുന്നതിന് കാരണമാകുന്നു.ഇന്റർഫെറോൺ-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് പ്രോട്ടീനുകളുടെ ഡൊമെയ്‌നിലെ പുതിയ പ്രോട്ടീൻ-പ്രോട്ടീൻ ഇടപെടലുകൾ കണ്ടെത്തുന്നതിന് ഞങ്ങൾ DSS-മെഡിയേറ്റഡ് ക്രോസ്-ലിങ്ക് മാസ് സ്പെക്‌ട്രോമെട്രി (CLMS) പ്രയോഗിച്ചു.പ്രതീക്ഷിക്കുന്ന ഇന്റർഫെറോൺ-ഇൻഡ്യൂസിബിൾ പ്രോട്ടീനുകൾക്ക് പുറമേ, MX1, USP18, OAS3, STAT1 തുടങ്ങിയ കാനോനിക്കൽ ഇന്റർഫെറോൺ-ഇൻഡ്യൂസിബിൾ പ്രോട്ടീനുകളുടെ പുതിയ ഇന്റർമോളിക്യുലർ, ഇൻട്രാമോളിക്യുലാർ ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് അഡക്‌റ്റുകളും ഞങ്ങൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു.കോ-ഇമ്യൂണോപ്രിസിപിറ്റേഷൻ ഉപയോഗിച്ച് HLA-A പ്രോട്ടീനുകൾ (H2BFS-HLA-A-HMGA1) രൂപീകരിച്ച ഇന്റർഫെറോൺ-ഇൻഡക്‌സിബിൾ പ്രോട്ടീൻ നെറ്റ്‌വർക്കുകളുടെ ഒരു നോവൽ സെറ്റിന്റെ ഓർത്തോഗണൽ മൂല്യനിർണ്ണയത്തിലും മോളിക്യുലാർ ഡൈനാമിക്സ് മോഡലിംഗ് ഉപയോഗിച്ചുള്ള അവരുടെ തുടർന്നുള്ള പഠനത്തിലും ഞങ്ങൾ ശ്രദ്ധ കേന്ദ്രീകരിച്ചു.പ്രോട്ടീൻ സമുച്ചയത്തിന്റെ അനുരൂപമായ ചലനാത്മകതയുടെ മോഡലിംഗ് CLMS കണ്ടെത്തലുകളിൽ തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുള്ള ഇടപെടലുകളെ പ്രതിഫലിപ്പിക്കുന്ന നിരവധി ഇന്ററാക്ഷൻ സൈറ്റുകൾ വെളിപ്പെടുത്തി.ഇന്റർഫെറോൺ പ്രേരിപ്പിച്ച പുതിയ സിഗ്നലിംഗ് കോംപ്ലക്സുകൾ തിരിച്ചറിയുന്നതിനായി ഞങ്ങൾ ഒരുമിച്ച് CLMS-ന്റെ ഒരു പൈലറ്റ് പഠനം അവതരിപ്പിക്കുന്നു, കൂടാതെ ട്യൂമർ മൈക്രോ എൻവയോൺമെന്റിലെ പ്രോട്ടീൻ ഇടപെടലുകളുടെ പുതിയ ചലനാത്മകത തിരിച്ചറിയാൻ CLMS-ന്റെ വിപുലമായ ഉപയോഗത്തിനായി കാത്തിരിക്കുന്നു.
ഒരു അഡാപ്റ്റീവ് ഇമ്മ്യൂൺ പ്രതികരണം ആരംഭിക്കുന്നതിന് മുമ്പ്, ഹോസ്റ്റിന്റെ സഹജമായ പ്രതിരോധ സംവിധാനം ഇന്റർഫെറോണുകൾ (IFNs) എന്ന് വിളിക്കപ്പെടുന്ന സ്രവിക്കുന്ന ആൽഫ-ഹെലിക് സൈറ്റോകൈനുകളുടെ ഒരു കുടുംബത്തിന്റെ മധ്യസ്ഥതയിൽ ഒരു ആന്റിമൈക്രോബയൽ പ്രതികരണം മൌണ്ട് ചെയ്യുന്നു.തരം I IFN ക്ലാസുകൾ IFNα, IFNβ എന്നിവ ആൻറിവൈറൽ, പ്രോപ്പോപ്റ്റോട്ടിക്, പ്രോഇൻഫ്ലമേറ്ററി, ആന്റിപ്രോലിഫെറേറ്റീവ് അവസ്ഥകൾ എന്നിവയുൾപ്പെടെ സെല്ലുലാർ പ്രതികരണങ്ങളെ സജീവമാക്കുന്നു.മനുഷ്യരിൽ, IFNα യുടെ 13 ഉപവിഭാഗങ്ങൾ അറിയപ്പെടുന്നു, എല്ലാം ക്രോമസോം 91-ൽ ക്ലസ്റ്ററായിരിക്കുന്നു. അതിശയകരമെന്നു പറയട്ടെ, ക്ലിനിക്കൽ ഉപയോഗത്തിനായി IFNα2 മാത്രമേ പഠിച്ചിട്ടുള്ളൂ.അടുത്തിടെ, IFNα യുടെ മറ്റ് ഉപവിഭാഗങ്ങളെക്കുറിച്ചുള്ള ഗവേഷണത്തിന് പ്രത്യേക ശ്രദ്ധ നൽകിയിട്ടുണ്ട്.കാനോനിക്കൽ IFNα2 സബ്‌ടൈപ്പുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ HBV2, HIV-13,4 പകർപ്പുകൾ എന്നിവ നിയന്ത്രിക്കുന്നതിനുള്ള ഏറ്റവും ഫലപ്രദമായ ഐസോഫോമുകളിൽ ഒന്നാണ് IFNα14 എന്ന് സമീപകാല പഠനം കാണിക്കുന്നു.
സജീവമാക്കിയ ടൈപ്പ് I ഇന്റർഫെറോൺ റിസപ്റ്റർ കോംപ്ലക്സുകൾ (IFNAR1, IFNAR2) ജാനസ് കൈനാസുകൾ TYK2, JAK15,6 എന്നിവയുടെ മധ്യസ്ഥതയിൽ ഒരു സിഗ്നൽ ട്രാൻസ്‌ഡക്ഷൻ കാസ്‌കേഡ് ട്രിഗർ ചെയ്യുന്നുവെന്ന് സ്ഥാപിക്കപ്പെട്ടു.SH2 ഡൊമെയ്ൻ-മെഡിയേറ്റഡ് ഹെറ്ററോഡൈമറൈസേഷൻ ആരംഭിക്കുന്നതിന് ഈ ജാനസ് കൈനസ് ഫോസ്ഫോറിലേറ്റ് സിഗ്നൽ ട്രാൻസ്ഡ്യൂസറുകളും ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ പ്രോട്ടീൻ ആക്റ്റിവേറ്ററുകളും (STAT1, STAT2) ടൈറോസിൻ അവശിഷ്ടങ്ങളിൽ ഉപയോഗിക്കുന്നു.തുടർന്ന്, IRF9 STAT ഹെറ്ററോഡൈമറുകളെ ബന്ധിപ്പിച്ച് IFN-ഉത്തേജിത ഘടകം 3 ജീനിന്റെ (ISGF3) ഒരു ട്രൈമെറിക് കോംപ്ലക്സ് ഉണ്ടാക്കുന്നു, ഇത് ന്യൂക്ലിയസിലേക്ക് മാറ്റുകയും 2000-ലധികം ഇന്റർഫെറോൺ-ഉത്തേജിത ജീനുകളുടെ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പ്രേരിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു (ISGs,8,6,8).
ISG-കൾ സഹജമായ രോഗപ്രതിരോധ സംവിധാനത്തിന്റെ നട്ടെല്ലാണ്, പ്രത്യേകിച്ച് വൈറൽ ആക്രമണത്തോടുള്ള പ്രതികരണമായി.വൈറൽ അണുബാധയ്‌ക്കെതിരായ പ്രതിരോധത്തിന്റെ ആദ്യ നിരയെന്ന നിലയിൽ, സെല്ലുലാർ പ്രോട്ടീനുകളുടെ വിപുലമായ ഇടപെടലുകളെ വൈവിധ്യമാർന്ന ജൈവ പ്രവർത്തനങ്ങളുമായി കോശങ്ങൾ അതിവേഗം വിന്യസിക്കുന്നു.ഈ പ്രോട്ടീനുകളിൽ പാറ്റേൺ റെക്കഗ്നിഷൻ റിസപ്റ്ററുകൾ, സിഗ്നലിംഗ് തന്മാത്രകൾ, ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകങ്ങൾ, നേരിട്ടുള്ള ആൻറിവൈറൽ പ്രവർത്തനങ്ങളുള്ള പ്രോട്ടീനുകൾ, അതുപോലെ രോഗപ്രതിരോധ പ്രതികരണങ്ങളുടെ നെഗറ്റീവ് റെഗുലേറ്ററുകൾ എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു.ISG പ്രവർത്തനത്തെക്കുറിച്ചുള്ള വിവരങ്ങളിൽ ഭൂരിഭാഗവും ലഭിക്കുന്നത് ഓവർ എക്സ്പ്രഷൻ സ്ക്രീനുകൾ 10,11 അല്ലെങ്കിൽ ജീൻ സൈലൻസിംഗ് ടെക്നിക്കുകൾ (siRNA, RNAi, CRISPR) 12,13 എന്നിവ ഉപയോഗിച്ചുള്ള ഫംഗ്ഷണൽ സ്ക്രീനുകളിൽ നിന്നാണ്, അതിൽ വ്യക്തിഗത ISG-കൾ പ്രകടിപ്പിക്കുകയോ നിരോധിക്കുകയോ ചെയ്യുന്നു, കൂടാതെ അവയുടെ പ്രവർത്തനം വിവിധ വൈറസുകളിൽ പരീക്ഷിക്കപ്പെടുന്നു.ഈ പഠനങ്ങൾ വ്യക്തിഗത ISG-കളുടെ ആൻറിവൈറൽ ഗുണങ്ങൾ നിർണ്ണയിച്ചിട്ടുണ്ടെങ്കിലും, ഓരോ ISG-യുടെയും അടിസ്ഥാന തന്മാത്രാ സംവിധാനങ്ങൾ ഏറെക്കുറെ അജ്ഞാതമായി തുടരുന്നു.പൂർണ്ണമായ പ്രവർത്തനം ഉറപ്പാക്കാൻ പല പ്രോട്ടീനുകളും ഒന്നോ അതിലധികമോ സൈറ്റോകൈനുകളുമായി ഇടപഴകുന്നുവെന്നത് പൊതുവെ അംഗീകരിക്കപ്പെട്ടിട്ടുള്ളതാണ്, അതിനാൽ ഒന്നുകിൽ ISG-കൾ നേരിട്ട് സംവദിക്കുന്നു അല്ലെങ്കിൽ അവയുടെ ഇടപെടലുകൾ സെല്ലുലാർ പ്രോട്ടീനുകൾ വഴിയാണ്.ഉദാഹരണത്തിന്, സമീപകാല ഫോട്ടോക്രോസ്ലിങ്ക്ഡ് പ്രോട്ടിയോമിക്സ് പഠനം ATPase VCP/p97-നെ ഒരു പ്രധാന IFITM3 ഇന്ററാക്ഷൻ പങ്കാളിയായി തിരിച്ചറിഞ്ഞു, ഇതിന്റെ തടസ്സം വൈറൽ കണങ്ങളുള്ള IFITM3 ന്റെ ലൈസോസോമൽ സോർട്ടിംഗ്, വിറ്റുവരവ്, കോട്രാൻസ്പോർട്ട് എന്നിവയിലെ അപാകതകളിലേക്ക് നയിക്കുന്നു.ഇമ്മ്യൂണോപ്രെസിപിറ്റേഷൻ ഉപയോഗിച്ച്, കൊളസ്‌ട്രോൾ-മധ്യസ്ഥതയുള്ള വൈറൽ പക്വതയെ മധ്യസ്ഥമാക്കുന്ന IFITM1/2/3-യുമായുള്ള ആശയവിനിമയ പങ്കാളിയായി വെസിക്കിൾ-അസോസിയേറ്റഡ് പ്രോട്ടീനായ VAPA-യെ ഞങ്ങൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു, യീസ്റ്റ് ടു-ഹൈബ്രിഡ് സിസ്റ്റം ഉപയോഗിച്ചുള്ള മറ്റൊരു പഠനത്തിലൂടെ ഇത് സ്ഥിരീകരിച്ചു.ശാസ്ത്രീയ പിന്തുണ 15, 16.
പ്രധാന ഹിസ്റ്റോകോംപാറ്റിബിലിറ്റി കോംപ്ലക്‌സ് (എംഎച്ച്‌സി) തന്മാത്രകളാൽ മധ്യസ്ഥത വഹിക്കുന്ന ആന്റിജൻ അവതരണമാണ് അണുബാധയെയും മാരകമായ പരിവർത്തനത്തെയും അടിച്ചമർത്തുന്നതിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന ഒരു അടിസ്ഥാന ജൈവ പ്രക്രിയ.പിളർന്നതും അകാലത്തിൽ അവസാനിപ്പിച്ചതും തെറ്റായി മടക്കിയതുമായ പ്രോട്ടീനുകളിൽ നിന്നുള്ള പെപ്റ്റൈഡുകൾ (8-12 അമിനോ ആസിഡുകൾ) MHC-I ഹെറ്ററോഡൈമറിലേക്ക് ലോഡ് ചെയ്യുന്നു (MHC-I ഹെവി, ലൈറ്റ് ചെയിനുകൾ അടങ്ങിയതാണ്, β-2-മൈക്രോഗ്ലോബുലിൻ; β2M) 17,18 .തത്ഫലമായുണ്ടാകുന്ന സ്ഥിരതയുള്ള MHC-I ട്രൈമറുകൾ സെൽ ഉപരിതലത്തിലേക്ക് കൊണ്ടുപോകുന്നു, അവിടെ അവ ഇൻട്രാ സെല്ലുലാർ പെപ്റ്റൈഡുകൾ CD8+ T സെല്ലുകളിലേക്ക് (സൈറ്റോടോക്സിക് ടി സെല്ലുകൾ) അവതരിപ്പിക്കുന്നു.ടി സെല്ലുകൾ ഈ രോഗകാരികളെയും ട്യൂമർ-നിർദ്ദിഷ്ട ആന്റിജൻ വഹിക്കുന്ന കോശങ്ങളെയും തിരിച്ചറിയുകയും നശിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.തൽഫലമായി, രോഗപ്രതിരോധ നിരീക്ഷണം ഒഴിവാക്കാൻ രോഗകാരികളും ട്യൂമർ കോശങ്ങളും പലപ്പോഴും ആന്റിജൻ അവതരണ പ്രക്രിയയെ അടിച്ചമർത്തുന്നു.കൂടാതെ, 40-90% മനുഷ്യ ട്യൂമറുകളിൽ MHC-I നിയന്ത്രണാതീതമാണ്, ഇത് പലപ്പോഴും മോശമായ രോഗനിർണയവുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു.
രോഗകാരികളോട് പ്രതികരിക്കുന്നതിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന ജീനുകൾ വിശ്രമാവസ്ഥയ്ക്കും സജീവമായ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ അവസ്ഥയ്ക്കും ഇടയിൽ വേഗത്തിൽ മാറണം.അതിനാൽ, പ്രൊമോട്ടർ ക്രോമാറ്റിൻ 20,21 ന്റെ പുനർനിർമ്മാണവും പരിഷ്ക്കരണവും ഉൾപ്പെടെ, കുറഞ്ഞ സമയത്തിനുള്ളിൽ ഉയർന്ന IFN ഡിമാൻഡിനുള്ള പ്രതികരണത്തിൽ നിരവധി സെല്ലുലാർ പ്രോട്ടീനുകൾ ഉൾപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെന്ന് അനുമാനിക്കപ്പെടുന്നു.മിക്ക പഠനങ്ങളും IFN ന്റെ സാന്നിധ്യത്തിൽ വ്യക്തിഗത ISG പ്രോട്ടീൻ പങ്കാളികളെ തിരിച്ചറിയുന്നതിൽ ശ്രദ്ധ കേന്ദ്രീകരിച്ചിട്ടുണ്ട്.മോഡൽ സെൽ സിസ്റ്റങ്ങളിലെ നിരവധി പ്രോട്ടോമിക്, ട്രാൻസ്‌ക്രിപ്‌റ്റോമിക് പഠനങ്ങൾ സെല്ലുലാർ ലാൻഡ്‌സ്‌കേപ്പിൽ IFN-ന്റെ സ്വാധീനം വ്യക്തമാക്കുന്നുണ്ട്.എന്നിരുന്നാലും, ഇന്റർഫെറോണുകൾ പ്രേരിപ്പിച്ച ചലനാത്മകതയെക്കുറിച്ച് വളർന്നുവരുന്ന ധാരണ ഉണ്ടായിരുന്നിട്ടും, ISG-കളുടെ പങ്കാളിത്തത്തെക്കുറിച്ച് ഞങ്ങൾക്ക് ഇപ്പോഴും വളരെക്കുറച്ചേ അറിയൂ.ഇന്റർഫെറോൺ സിഗ്നലിംഗിന്റെ സങ്കീർണ്ണതയും സമയാധിഷ്ഠിത ചലനാത്മകതയും പരിഗണിക്കുമ്പോൾ, രണ്ട് ചോദ്യങ്ങൾ ഉയർന്നുവരുന്നു: (i) ഫാസ്റ്റ് സിഗ്നലിംഗിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന മൾട്ടിപ്രോട്ടീൻ കോംപ്ലക്സുകളെ സ്ഥിരപ്പെടുത്താനും കുടുക്കാനും കഴിയുമോ, (ii) ഈ ഇടപെടലുകളെ 3D സ്പേസിലേക്ക് മാപ്പ് ചെയ്യാൻ കഴിയുമോ?
ഈ പ്രശ്‌നങ്ങൾ പരിഹരിക്കുന്നതിന്, IFNα-ഇൻഡ്യൂസ്‌ഡ് പ്രോട്ടീൻ ഇന്ററാക്ഷൻ നെറ്റ്‌വർക്കിനെയും അതിന്റെ ചലനാത്മകതയെയും കുറിച്ച് പഠിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ഡിസ്‌സിനിമൈഡ് സബറേറ്റ്-മെഡിയേറ്റഡ് കെമിക്കൽ ക്രോസ്-ലിങ്കിംഗ് (ഡിഎസ്എസ്) മാസ് സ്പെക്‌ട്രോമെട്രി (സിഎൽഎംഎസ്) ഉപയോഗിച്ച് നടപ്പിലാക്കി.പ്രോട്ടീനുകളുടെ പ്രോക്സിമൽ അവശിഷ്ടങ്ങൾ കൂടാതെ/അല്ലെങ്കിൽ വിവോയിലെ പ്രോട്ടീൻ കോംപ്ലക്സുകൾക്കിടയിൽ DSS ​​കോവാലന്റ് ബോണ്ടുകൾ ചേർക്കുന്നു.തുടർന്നുള്ള MS വിശകലനം ഒരു പ്രത്യേക പ്രോട്ടീനിനുള്ളിലെ പ്രദേശങ്ങളുടെ സ്പേഷ്യൽ സാമീപ്യത്തെ പ്രതിഫലിപ്പിക്കുന്ന നിർദ്ദിഷ്ട ക്രോസ്ലിങ്കിംഗ് സൈറ്റുകൾ വെളിപ്പെടുത്തുന്നു, ആന്തരിക ലിങ്കേജുകൾ അല്ലെങ്കിൽ പ്രോട്ടീൻ കോംപ്ലക്സുകളിലെ ഉപയൂണിറ്റുകൾ, പരസ്പര ബന്ധങ്ങൾ എന്ന് വിളിക്കുന്നു.ഈ സമീപനം ഉപയോഗിച്ച്, ഞങ്ങൾ നിരവധി പുതിയ പ്രോട്ടീൻ-പ്രോട്ടീൻ കോംപ്ലക്സുകളും ഇന്റർഫെറോൺ-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് മൾട്ടിപ്രോട്ടീൻ ഇന്ററാക്ഷൻ നെറ്റ്‌വർക്കുകളും തിരിച്ചറിഞ്ഞു.ഈ പുതിയ ഇടപെടലുകളുടെ ഒരു ഉപവിഭാഗം കൂടുതൽ പരിശോധിക്കുന്നതിലൂടെ, H2BFS (H2B ഹിസ്റ്റോൺ-ടൈപ്പ് FS; ഇനി മുതൽ H2B എന്ന് വിളിക്കപ്പെടുന്നു) കൂടാതെ MDN1 എന്നിവ HLA-A-യുടെ ബൈൻഡിംഗ് പാർട്ണർമാരായി പ്രവർത്തിക്കുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ തെളിയിക്കുന്നു.
അന്നനാളത്തിലെ മുഴകളുടെ പ്രധാന സവിശേഷതകൾ അനുകരിക്കുന്നതിനാൽ അന്നനാളത്തിലെ അഡിനോകാർസിനോമയുടെ വിട്രോ മോഡലുകളിൽ ഏറ്റവും അറിയപ്പെടുന്ന ഒന്നാണ് ഫ്ലോ-1 സെല്ലുകൾ.എന്നിരുന്നാലും, എല്ലാ മുഴകളും ഇമ്മ്യൂണോജെനിക് അല്ല, Flo-1 കോശങ്ങൾ ഇന്റർഫെറോൺ ചികിത്സയോട് പ്രതികരിക്കുന്നുണ്ടോ എന്ന് നിർണ്ണയിക്കാൻ, ഞങ്ങൾ Flo-1 കോശങ്ങളെ 10 ng/ml IFNα ഉപയോഗിച്ച് 72 മണിക്കൂർ ചികിത്സിച്ചു.ഫ്ലോ-1 സെല്ലുകൾ pSTAT1, IRF1 എന്നിവയുടെ ആദ്യകാല ഇൻഡക്ഷൻ കാണിച്ചു, ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം 2 മണിക്കൂർ ആരംഭിച്ച് 72 മണിക്കൂർ വരെ തുടരുന്നു, IRF1 ന്റെ നിശ്ചല നിലകളിൽ സമയത്തെ ആശ്രയിച്ചുള്ള കുറവ് (ചിത്രം 1A).ISG-കൾ (MX1, IFITM1, OAS1/2, ISG15) 6 മണിക്കൂറിന് ശേഷം ശക്തമായി പ്രേരിപ്പിച്ചതായി കണ്ടെത്തി, IFNα-യിലേക്കുള്ള ക്ലാസിക് മിഡ്, ലേറ്റ് ഫേസ് പ്രതികരണങ്ങളെ അനുകരിക്കുന്നു (ചിത്രം 1A).ഇന്റർഫെറോൺ പ്രതികരണങ്ങൾ പഠിക്കാൻ ഈ സെല്ലുലാർ മോഡൽ ഉപയോഗിക്കാമെന്ന് ഈ ഡാറ്റ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
IFNα ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം Flo-1 സെല്ലുകളിലെ ഡിഫറൻഷ്യൽ പ്രോട്ടീൻ എക്സ്പ്രഷൻ പ്രതികരണങ്ങൾ.(A) 2, 6, 24, 48, 72 മണിക്കൂർ 10 ng/ml IFNα ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ച Flo-1 സെല്ലുകളിലെ പ്രോട്ടീൻ എക്സ്പ്രഷൻ സൂചിപ്പിച്ച ISG ആന്റിബോഡികൾ ഉപയോഗിച്ച് ഇമ്മ്യൂണോബ്ലോട്ട് വിശകലനം ചെയ്തു.(ബി) സൂചിപ്പിച്ച സമയങ്ങൾക്കും സാന്ദ്രതകൾക്കുമായി DSS-മായി ക്രോസ്-ലിങ്ക് ചെയ്‌ത ശേഷം മുഴുവൻ സെൽ എക്‌സ്‌ട്രാക്‌റ്റുകളുടെയും കൂമാസ്സി ബ്ലൂ സ്റ്റെയിൻഡ് SDS-PAGE ജെൽസ്.(C) പ്രോട്ടീൻ ക്രോസ്-ലിങ്കിംഗിന്റെ അളവ് വിലയിരുത്തുന്നതിന് അതേ സാമ്പിളുകളിൽ നിന്ന് p53(DO-1) ആന്റിബോഡി ഉപയോഗിച്ച് പ്രതിനിധി ഇമ്മ്യൂണോബ്ലോട്ട് പരിശോധിച്ചു.
ഇൻ സിറ്റു പ്രോട്ടീൻ ഇന്ററാക്ഷൻ ലാൻഡ്‌സ്‌കേപ്പ് ക്യാപ്‌ചർ ചെയ്യാൻ, ഉയർന്ന മെംബ്രൺ പെർമാസബിലിറ്റിയും താരതമ്യേന കുറഞ്ഞ പ്രതികരണ സമയവും കാരണം വ്യാപകമായി ഉപയോഗിക്കുന്ന ക്രോസ്-ലിങ്കിംഗ് ഏജന്റായ DSS ഞങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ചു.ചെറിയ പ്രതികരണ സമയം, ക്രോസ്ലിങ്ക്ഡ് പ്രോട്ടീനുകളുടെ വലിയ അഗ്രഗേറ്റുകളുടെ രൂപീകരണം തടയാൻ സഹായിക്കുന്നു, അതുവഴി ക്രോസ്ലിങ്കറിന്റെ സ്ഥിരത നിലനിർത്തുന്നു.ഒപ്റ്റിമൽ ഡിഎസ്എസ് കോൺസൺട്രേഷൻ നിർണ്ണയിക്കുന്നതിനും ഓവർ-ക്രോസ്ലിങ്കിംഗ് ഒഴിവാക്കുന്നതിനും, ഞങ്ങൾ ആദ്യം സെല്ലുകളെ യഥാക്രമം 5, 10, 5, 30 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 5, 2.5, 1 mM DSS-ലേക്ക് തുറന്നുകാട്ടുകയും Coomassie-stained SDS-PAGE വഴി ലൈസേറ്റ് വിശകലനം ചെയ്യുകയും ചെയ്തു. (ഡാറ്റ കാണിച്ചിട്ടില്ല) .ഏറ്റവും കുറഞ്ഞ ഏകാഗ്രതയിലും കുറഞ്ഞ സമയത്തും സെൽ ലൈസറ്റുകൾ വളരെ ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് ആയി കാണപ്പെടുന്നു.അതിനാൽ, DSS 5 മിനിറ്റിൽ 1, 0.5, 0.1 mM എന്നിങ്ങനെ ടൈട്രേറ്റ് ചെയ്തു (ചിത്രം 1B).5 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 0.5 mM DSS ഉപയോഗിച്ച് ഒപ്റ്റിമൽ ക്രോസ്ലിങ്കിംഗ് നിരീക്ഷിച്ചു, IFNα ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിക്കുന്ന സെല്ലുകൾക്കായി ഈ വ്യവസ്ഥകൾ തിരഞ്ഞെടുത്തു.കൂടാതെ, പ്രോട്ടീൻ ക്രോസ്-ലിങ്കിംഗിന്റെ അളവ് വിലയിരുത്തുന്നതിന് p53 (DO-1) ആന്റിബോഡി ഉപയോഗിച്ച് നടത്തിയ വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ട് ചിത്രം 1C കാണിക്കുന്നു.
ക്രോസ്ലിങ്കർ ചേർക്കുന്നതിന് മുമ്പ് Flo-1 സെല്ലുകൾ 24 മണിക്കൂർ 10 ng/ml IFNα ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ചു.ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് സെല്ലുകൾ പിന്നീട് രണ്ട്-ഘട്ട പ്രോട്ടിയോളിസിസ് വഴി ലൈസ് ചെയ്യുകയും പ്രോട്ടീനുകൾ FASP വഴി പ്രോസസ്സ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു (ചിത്രം 2)24,25.ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് ട്രിപ്റ്റിക് പെപ്റ്റൈഡുകൾ മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി ഉപയോഗിച്ച് വിശകലനം ചെയ്തു (ചിത്രം 2).MS/MS സ്പെക്ട്രയെ പ്രോട്ടീൻ ശ്രേണിയുമായി പൊരുത്തപ്പെടുത്തുകയും MaxQuant26,27 ഉപയോഗിച്ച് കണക്കാക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.SIM-XL പ്രോഗ്രാം ഉപയോഗിച്ച് ലഭിച്ച സ്പെക്ട്രയിൽ നിന്ന് ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് പെപ്റ്റൈഡുകൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു, കൂടാതെ വ്യക്തിഗത സംയുക്തങ്ങൾ xQuest28, SIM-XL29 ഓപ്പൺ സോഴ്സ് കമ്പ്യൂട്ടിംഗ് സോഫ്റ്റ്വെയർ പൈപ്പ്ലൈനുകൾ (ചിത്രം 2) ഉപയോഗിച്ച് സങ്കീർണ്ണമായ നെറ്റ്‌വർക്കിലേക്ക് സംയോജിപ്പിച്ചു.സിം-എക്സ്എൽ പ്രോട്ടീൻ-പ്രോട്ടീൻ ഇടപെടലുകൾ, ആന്തരിക ശൃംഖലകൾ, വ്യക്തിഗത ശൃംഖലകൾ എന്നിവ ലളിതമോ സങ്കീർണ്ണമോ ആയ പ്രോട്ടീൻ മിശ്രിതങ്ങളിൽ തിരിച്ചറിയുകയും പ്രോട്ടീൻ ഘടനകളിലെ ഇടപെടലുകൾ ദൃശ്യവൽക്കരിക്കുന്നതിനുള്ള സ്ക്രിപ്റ്റുകൾ നൽകുകയും ചെയ്യുന്നു.കൂടാതെ, ഇത് MS/MS29 സ്പെക്‌ട്രം നിലവാരം അനുസരിച്ച് ഓരോ ക്രോസ്-റഫറൻസിനെയും ഒരു ഐഡി സ്‌കോറായി റാങ്ക് ചെയ്യുന്നു.വളരെ വിശ്വസനീയമായ നിരവധി പ്രോട്ടീൻ-പ്രോട്ടീൻ ഇടപെടലുകളും കോംപ്ലക്സുകളും തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുണ്ട്, കൂടാതെ കോ-ഇമ്യൂണോപ്രെസിപിറ്റേഷനും കോംപ്ലക്സുകളുടെ അനുരൂപമായ മാറ്റങ്ങളും ഉപയോഗിച്ച് ഒരു പുതിയ കൂട്ടം ഇടപെടലുകൾ കൂടുതൽ അന്വേഷിച്ചു.
CLMS രീതിയുടെ സ്കീമാറ്റിക് അവലോകനം.ഫ്ലോ-1 സെല്ലുകൾ 10 ng/ml IFNα ഉപയോഗിച്ച് 24 മണിക്കൂർ ചികിത്സിച്ചു, തുടർന്ന് DSS ഉപയോഗിച്ച് സിറ്റു പ്രോട്ടീൻ ക്രോസ്-ലിങ്കിംഗിൽ സെൽ ലിസിസും ട്രൈപ്സിനൈസേഷനും ഉപയോഗിച്ചു.ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് സാമ്പിളുകൾ ഒരു Orbitrap മാസ് സ്പെക്ട്രോമീറ്റർ ഉപയോഗിച്ച് വിശകലനം ചെയ്യുകയും LC-MS/MS സമയത്ത് പെപ്റ്റൈഡ് മുൻഗാമികളുടെ വിഘടനത്തിനായി കൂടുതൽ സാമ്പിൾ എടുക്കുകയും ചെയ്തു.ക്രോസ്ലിങ്ക്ഡ് പെപ്റ്റൈഡ്സ് (SIM-XL) പ്രോഗ്രാമിന്റെ സ്പെക്ട്രം റെക്കഗ്നിഷൻ മെഷീൻ ഉപയോഗിച്ച് ലഭിച്ച സ്പെക്ട്രയിൽ നിന്ന് രണ്ട് ലിങ്ക്ഡ് പെപ്റ്റൈഡുകൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു, കൂടാതെ എല്ലാ സംയുക്തങ്ങളും കമ്പ്യൂട്ടേഷണൽ പൈപ്പ്ലൈനുകൾ ഉപയോഗിച്ച് സങ്കീർണ്ണമായ ഒരു നെറ്റ്‌വർക്കിലേക്ക് സംയോജിപ്പിച്ചു.തെറ്റായ പോസിറ്റീവ് റേറ്റ് (FDR) സ്‌കോറുകളെ അടിസ്ഥാനമാക്കി കുറഞ്ഞ ആത്മവിശ്വാസമുള്ള ഇടപെടലുകൾ ഫിൽട്ടർ ചെയ്യുക.കോ-ഇമ്മ്യൂണോപ്രിസിപിറ്റേഷൻ ഉപയോഗിച്ച് നിരവധി പുതിയ ഉയർന്ന-ഫിഡിലിറ്റി പ്രോട്ടീൻ-പ്രോട്ടീൻ ഇടപെടലുകൾ കൂടുതൽ സ്ഥിരീകരിച്ചു, കൂടാതെ മോളിക്യുലർ ഡൈനാമിക്സ് (എംഡി) മോഡലിംഗ് ഉപയോഗിച്ച് കോംപ്ലക്സുകളിലെ അനുരൂപമായ മാറ്റങ്ങൾ പരിശോധിച്ചു.
ഉത്തേജിപ്പിക്കപ്പെടാത്തതും ഉത്തേജിപ്പിക്കപ്പെട്ടതുമായ IFNα സാമ്പിളുകളിൽ MaxQuant ഉപയോഗിച്ച് യഥാക്രമം ~30,500, ~28,500 പെപ്റ്റൈഡുകൾ കണ്ടെത്തി (സപ്ലിമെന്ററി പട്ടിക S1, ചിത്രം. 3A).രണ്ട് സാഹചര്യങ്ങളിലും പെപ്റ്റൈഡ് നീളം വിതരണം വലിയ പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ ഉയർന്ന അനുപാതം കാണിക്കുന്നു, ഇത് ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ സാന്നിധ്യം സൂചിപ്പിക്കുന്നു (ചിത്രം 3B,C).കൂടാതെ, IFNα- ചികിത്സിച്ച സാമ്പിളുകളിൽ (ചിത്രം 3C) 40-55 ശ്രേണിയിൽ വലിയ പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ ഒരു വലിയ അനുപാതം ഉണ്ടായിരുന്നു.MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58, HLA-F (ചിത്രം 3D) എന്നിവയുൾപ്പെടെ ചികിത്സിക്കാത്ത സാമ്പിളുകളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, log2 തീവ്രതയ്‌ക്കെതിരായ പ്രോട്ടീൻ മാപ്പിംഗ് ക്ലാസിക് ഇന്റർഫെറോൺ-ഉത്തേജിത പ്രോട്ടീനുകൾ ഏറ്റവും സമൃദ്ധമാണെന്ന് കാണിച്ചു.റിയാക്ടോം പാത്ത്‌വേ ഡാറ്റാബേസ് ഉപയോഗിച്ചുള്ള IFNα ചികിത്സയ്ക്കുള്ള പ്രതികരണമായി പ്രോട്ടീനുകൾക്കായുള്ള പാത്ത്‌വേകളുടെ വിശകലനം, MHC-I-മെഡിയേറ്റഡ് ആന്റിജൻ അവതരണവും പ്രോസസ്സിംഗും ഏറ്റവും പ്രബലമായ പാതയാണെന്ന് കാണിക്കുന്നു (ചിത്രം 3E).മുമ്പത്തെ റിപ്പോർട്ടുകൾക്ക് അനുസൃതമായി, OAS, ISG15 എന്നിവയുടെ മധ്യസ്ഥതയിലുള്ള ആൻറിവൈറൽ പ്രതികരണങ്ങളും IFNα/β, സൈറ്റോകൈൻ സിഗ്നലിംഗ് എന്നിവയും സജീവമാക്കിയ പാതകളിൽ ഉൾപ്പെടുന്നു.കൂടാതെ, SIM-XL ഉപയോഗിച്ച് യഥാർത്ഥത്തിൽ നേടിയ MS/MS സ്പെക്ട്രയിൽ നിന്ന് ലൈസിൻ-, സെറിൻ-നിർദ്ദിഷ്ട പ്രോട്ടീൻ ക്രോസ്-ലിങ്കുകൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു.5 സെൽ തരങ്ങളിലെ വ്യക്തിഗത ISG ഓവർ എക്സ്പ്രഷൻ പഠനങ്ങളുടെ മെറ്റാ അനാലിസിസ് വഴി 9 വൈറസ് ക്ലാസുകളിൽ നിന്നുള്ള 20 വൈറസുകൾ വ്യാപിച്ചുകിടക്കുന്ന 104 ISG-കൾ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തു.എന്നിരുന്നാലും, വലിയ ഡാറ്റാസെറ്റുകൾ സ്‌ക്രീൻ ചെയ്യുന്നതിനുള്ള കമ്പ്യൂട്ടേഷണൽ പരിമിതികൾ മറികടക്കാൻ, പഡാരിയ തുടങ്ങിയവർ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്‌ത IRDS ജീനുകളുടെ പട്ടിക തമ്മിലുള്ള സാധ്യമായ ഇടപെടലുകൾ പര്യവേക്ഷണം ചെയ്യുന്നതിനായി ഞങ്ങൾ ഒരു ചെറിയ ഡാറ്റാസെറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് ആരംഭിച്ചു, അവയിൽ മിക്കതും ISG-കളാണ്.
IFNα (MaxQuant-ൽ നിന്ന് ലഭിച്ച ഡാറ്റ) പ്രതികരണമായി വ്യത്യസ്തമായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് പ്രോട്ടീനുകളുടെ തിരിച്ചറിയൽ.(A) IFNα14 ചികിത്സിച്ചതും ചികിത്സിക്കാത്തതുമായ Flo-1 സാമ്പിളുകളിൽ തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുള്ള പൊതുവായതും പ്രത്യേകവുമായ പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ എണ്ണം പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന വെൻ ഡയഗ്രം.ചികിത്സിക്കാത്ത (B), IFNα ചികിത്സിച്ച (C) ക്രോസ്‌ലിങ്ക് ചെയ്‌ത സാമ്പിളുകളുടെ പെപ്റ്റൈഡ് ദൈർഘ്യം വിതരണം.(D) ചികിത്സയില്ലാത്തതും IFNα14 ചികിത്സിച്ചതുമായ Flo-1 സെല്ലുകൾക്കിടയിൽ log2 (LFQ തീവ്രത) പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന ഹീറ്റ് മാപ്പ്.ഇടത് പാനൽ IFNα യുടെ സാന്നിധ്യത്തിൽ ഏറ്റവും സജീവമായ പ്രോട്ടീനുകൾ കാണിക്കുന്നു.(ഇ) IFNα ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷമുള്ള 20 പ്രധാന സമ്പുഷ്ടീകരണ പാതകളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന ഹിസ്റ്റോഗ്രാം.റിയാക്‌ടോം പാത്ത്‌വേ ഡാറ്റാബേസ് നിയന്ത്രിത IFNα-പ്രതികരണ പ്രോട്ടീനുകളിൽ നാലിരട്ടിയിലധികം മാറ്റങ്ങൾ വിശകലനം ചെയ്തു.
ഇന്റർഫെറോൺ-മധ്യസ്ഥതയുള്ള ISG ഉത്തേജനം നന്നായി രേഖപ്പെടുത്തപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്, എന്നാൽ തന്മാത്രാ തലത്തിൽ ഈ പ്രോട്ടീനുകൾ എങ്ങനെ വൈവിധ്യമാർന്ന ജൈവ പ്രവർത്തനങ്ങളിൽ കലാശിക്കുന്നു എന്നത് മോശമായി മനസ്സിലാക്കപ്പെട്ടിട്ടില്ല.അറിയപ്പെടുന്ന ISG-കൾ തമ്മിലുള്ള ഉയർന്ന ആത്മവിശ്വാസത്തോടെ പ്രോട്ടീൻ ഇടപെടലുകൾ ഞങ്ങൾ അന്വേഷിച്ചു.രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, IFNα ചികിത്സയുടെ പ്രതികരണമായി ഒരു വലിയ സമുച്ചയം രൂപപ്പെടുന്ന MX1, USP18, ROBO1, OAS3, STAT1 പ്രോട്ടീനുകൾ എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്ന ഒരു നെറ്റ്‌വർക്ക് ഞങ്ങൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു (ചിത്രം 4, പട്ടിക S2) 32,33,34.ഏറ്റവും പ്രധാനമായി, ഈ ഇടപെടലുകൾ IFNα ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ച എല്ലാ ട്രിപ്പിലേറ്റുകളിലും കണ്ടെത്തി, അവ ചികിത്സിക്കാത്ത സാമ്പിളുകളിൽ കണ്ടെത്തിയില്ല, ഇത് IFNα ചികിത്സയുടെ പ്രതികരണമായി പ്രത്യേകമായി രൂപപ്പെട്ടതാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.ഈ ISG-കളുടെ പ്രകടനത്തെ STAT1 ട്രാൻസ്‌ക്രിപ്‌ഷണലായി നിയന്ത്രിക്കുന്നുവെന്ന് അറിയാം, പക്ഷേ പ്രോട്ടീൻ തലത്തിൽ ISG-കളുമായുള്ള അതിന്റെ ഇടപെടൽ പഠിച്ചിട്ടില്ല.STAT1-ന്റെ ക്രിസ്റ്റൽ ഘടന അതിന്റെ ഹെലിക്കൽ ഡൊമെയ്‌ൻ (CCD) ഡൈമേഴ്‌സ് രൂപീകരണ സമയത്ത് DNA അല്ലെങ്കിൽ പ്രോട്ടോമറുകളുമായുള്ള പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിൽ ഉൾപ്പെട്ടിട്ടില്ലെന്ന് കാണിച്ചു.ഈ α-ഹെലിസുകൾ ഒരു ഹെലിക്‌സ് ഹെലിക്‌സ് ഘടന ഉണ്ടാക്കുന്നു.ഞങ്ങളുടെ CLMS ഡാറ്റയിൽ, STAT1-യുമായുള്ള മിക്ക ഇടപെടലുകളും CCD, ലിങ്കർ ഡൊമെയ്ൻ അല്ലെങ്കിൽ C-ടെർമിനൽ ടെയിൽ (അവശിഷ്ടങ്ങൾ 700-708) (ചിത്രം 4A) എന്നിവയ്ക്ക് മുമ്പുള്ള SH2 ഡൊമെയ്‌നിൽ സംഭവിച്ചതായി ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു.STAT2-ന്റെ CCD, DNA-ബൈൻഡിംഗ് ഡൊമെയ്‌നുമായി (DBD) USP18 ബൈൻഡ് ചെയ്യുന്നുവെന്നും ടൈപ്പ് I ഇന്റർഫെറോൺ സിഗ്നലിംഗ് 24-നെ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നതിനായി ടൈപ്പ് I ഇന്റർഫെറോൺ റിസപ്റ്റർ IFNAR2-ന്റെ ഉപയൂണിറ്റിലേക്ക് റിക്രൂട്ട് ചെയ്യപ്പെടുന്നുവെന്നും ഒരു മുൻ പഠനം റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തു.USP18 കാറ്റലറ്റിക് ഡൊമെയ്‌ൻ STAT1 DBD (ചിത്രം 4A,D) യുമായി സംവദിക്കുന്നതായും ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ കാണിക്കുന്നു, USP18-നെ IFNAR2-ലേക്ക് ആകർഷിക്കുന്നതിൽ STAT1, STAT2 എന്നിവയ്ക്ക് ഒരു പങ്കുണ്ട്.
IFNα ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ച ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് സെല്ലുകളിൽ പ്രോട്ടീൻ-പ്രോട്ടീൻ ISG നെറ്റ്‌വർക്ക് തിരിച്ചറിഞ്ഞു.(A) പ്രോട്ടീൻ-പ്രോട്ടീൻ ഇടപെടലുകൾ കാണിക്കുന്ന 2D ഇന്ററാക്ഷൻ പ്ലോട്ട് (SIM-XL പ്രോഗ്രാമിൽ സൃഷ്ടിച്ചത്), ഇന്റർമോളിക്യുലാർ ഇന്ററാക്ഷനുകളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന ലൈനുകൾ (ക്രോസ്ലിങ്ക് കട്ട്ഓഫ് 3.5 ആയി സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്നു).വ്യത്യസ്ത ഐഡന്റിറ്റികളുടെ ഡൊമെയ്‌നുകൾ അവയുടെ വർണ്ണം കൊണ്ട് അടയാളപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു32: MX1 ഡൊമെയ്‌ൻ, ഡൈനാമിൻ_എൻ (73–249), ഡൈനാമിൻ_എം (259–547), ജിഇഡി (569–660).OAS3 ഡൊമെയ്‌നുകൾ: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872), OAS1_C (903-108).ഡൊമെയ്ൻ ROBO1, Ig_3 (67–151), I-സെറ്റ് (170–258), I-സെറ്റ് (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758), fn3 (777–864).STAT1 ഫീൽഡുകൾ: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657), STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) യഥാക്രമം നീല, ചുവപ്പ് എന്നീ നിറങ്ങളിൽ ലേബൽ ചെയ്‌തിരിക്കുന്ന ഇടപെടലുകളും ഇടപെടലുകളുമുള്ള ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് പ്രോട്ടീനുകളുടെ (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1, STAT1) സർക്കുലർ വ്യൂവർ.ക്രോസ്-ലിങ്ക് ത്രെഷോൾഡ് 3.5 ആയി സജ്ജീകരിച്ചു.ഡോട്ട് പ്ലോട്ടുകൾ MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E), OAS3 (F) എന്നിവയുള്ള STAT1 ഇന്ററാക്ഷൻ സൈറ്റുകളെയും രണ്ട് പെപ്റ്റൈഡുകൾക്കിടയിലുള്ള K അല്ലെങ്കിൽ S ഇന്ററാക്ഷൻ സൈറ്റുകളെയും സൂചിപ്പിക്കുന്നു.ചിത്രത്തിൽ, ക്രോസ്-ലിങ്ക് സ്കോർ ത്രെഷോൾഡ് 3.0 ആയി സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്നു.(ജി) STAT1, OAS3 DI ഡൊമെയ്‌നുകൾക്കിടയിലുള്ള വിവിധ ഇന്ററാക്ഷൻ സൈറ്റുകൾ PyMol-ലെ അവയുടെ പ്രോട്ടീൻ ഘടനകളിൽ സൂപ്പർഇമ്പോസ് ചെയ്‌തിരിക്കുന്നു (PyMOL മോളിക്യുലർ ഗ്രാഫിക്‌സ് സിസ്റ്റം, പതിപ്പ് 2.0 ഷ്രോഡിംഗർ, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533), OAS3 (pdb id: 4s3n34).) പ്രോഗ്രാം.
USP18 ന്റെ രണ്ട് ഐസോഫോമുകൾ മനുഷ്യരിൽ വിവരിച്ചിട്ടുണ്ട്, പ്രധാനമായും ന്യൂക്ലിയസിൽ സ്ഥിതിചെയ്യുന്ന ഒരു മുഴുനീള പ്രോട്ടീൻ, കൂടാതെ ഒരു N-ടെർമിനൽ ഡൊമെയ്ൻ ഇല്ലാത്ത ഒരു ഐസോഫോം, USP18-sf, ഇത് സൈറ്റോപ്ലാസ്മിലും ന്യൂക്ലിയസ് 36 ലും തുല്യമായി വിതരണം ചെയ്യപ്പെടുന്നു.കൂടാതെ, എൻ-ടെർമിനസ് ഘടനാരഹിതമാണെന്നും ഐസോപെപ്റ്റിഡേസ് പ്രവർത്തനമോ ISG1537 ബൈൻഡിംഗോ ആവശ്യമില്ലെന്നും പ്രവചിക്കപ്പെട്ടു.ഞങ്ങളുടെ പഠനത്തിൽ കണ്ടെത്തിയ മിക്ക ഇടപെടലുകളും പ്രോട്ടീന്റെ എൻ-ടെർമിനസിലാണ് സ്ഥിതി ചെയ്യുന്നത്, ഈ ഇടപെടലുകളിൽ പൂർണ്ണ ദൈർഘ്യമുള്ള USP18 (ചിത്രം 4A,D) ഉൾപ്പെടുന്നുവെന്നും അതിനാൽ ന്യൂക്ലിയസിൽ സംഭവിക്കാൻ സാധ്യതയുണ്ടെന്നും സൂചിപ്പിക്കുന്നു.കൂടാതെ, പ്രോട്ടീൻ-ടു-പ്രോട്ടീൻ ഇടപെടലുകൾക്കായി എൻ-ടെർമിനസ് സവിശേഷമായതാണെന്നും ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.IFNAR2 ബൈൻഡിംഗ് സൈറ്റ് 312-368 അവശിഷ്ടങ്ങൾക്കിടയിലാണ് സ്ഥിതി ചെയ്യുന്നത്, കൂടാതെ കോംപ്ലക്സിലെ പ്രോട്ടീനുകളൊന്നും ഈ മേഖലയുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നില്ല (ചിത്രം 4A) 37,38 .ഈ ഡാറ്റ ഒരുമിച്ച് എടുത്തത് IFNAR2 ബൈൻഡിംഗ് ഡൊമെയ്‌ൻ റിസപ്റ്റർ പ്രോട്ടീൻ മാത്രം ഉപയോഗിക്കുന്നതാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.കൂടാതെ, N-ടെർമിനസിന്റെയും IFNAR2 ബൈൻഡിംഗ് സൈറ്റിന്റെയും അപ്‌സ്ട്രീമിലുള്ള ഡൊമെയ്‌നുകളുമായി OAS3, ROBO1 എന്നിവ മാത്രമേ ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നുള്ളൂ (ചിത്രം 4A).
ട്രാൻസ്‌മെംബ്രെൻ സിഗ്നലിംഗ് തന്മാത്രകളുടെ ഇമ്യൂണോഗ്ലോബുലിൻ (Ig) സൂപ്പർ ഫാമിലിയിൽ പെട്ടതാണ് ROBO1, കൂടാതെ എക്സ്ട്രാ സെല്ലുലാർ മേഖലയിലെ അഞ്ച് Ig ഡൊമെയ്‌നുകളും മൂന്ന് ഫൈബ്രോനെക്റ്റിൻ (Fn) ഡൊമെയ്‌നുകളും അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു.ഈ എക്‌സ്‌ട്രാ സെല്ലുലാർ ഡൊമെയ്‌നുകൾക്ക് പിന്നാലെ ഒരു മെംബ്രൻ-പ്രോക്‌സിമൽ റീജിയനും സിംഗിൾ ട്രാൻസ്‌മെംബ്രൺ ഹെലിക്‌സും 39. ഒരു ഘടനയില്ലാത്ത ഇൻട്രാ സെല്ലുലാർ റീജിയൻ സി-ടെർമിനസിൽ സ്ഥിതിചെയ്യുന്നു, കൂടാതെ ഇഫക്‌ടർ പ്രോട്ടീൻ ബൈൻഡിംഗിനെ മധ്യസ്ഥമാക്കുന്ന സംരക്ഷിത സീക്വൻസ് മോട്ടിഫുകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു.അമിനോ ആസിഡുകൾ ~1100 മുതൽ 1600 വരെ നീളുന്ന പ്രദേശം മിക്കവാറും ക്രമരഹിതമാണ്.MX1, Ig, Fn, ഇൻട്രാ സെല്ലുലാർ ഡൊമെയ്‌നുകൾ വഴി ROBO1-മായി സംവദിക്കുന്നതായി ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി, അതേസമയം STAT1-മായുള്ള മിക്ക ഇടപെടലുകളും അതിന്റെ CCD, ലിങ്കർ ഡൊമെയ്‌ൻ, ROBO1-ന്റെ C-ടെർമിനസ് എന്നിവയ്‌ക്കിടയിലാണ് സംഭവിക്കുന്നത് (ചിത്രം 4A,E).മറുവശത്ത്, DI, DIII, OAS3 ലിങ്കർ മേഖലകളുമായുള്ള ഇടപെടലുകൾ ROBO1 പ്രോട്ടീനിലുടനീളം വിതരണം ചെയ്തു (ചിത്രം 4A).
ഒലിഗോഡെനൈലേറ്റ് സിന്തേസ് (ഒഎഎസ്) പ്രോട്ടീൻ കുടുംബം ഇൻട്രാ സെല്ലുലാർ ഡബിൾ സ്ട്രാൻഡഡ് ആർഎൻഎ (ഡിഎസ്ആർഎൻഎ) സ്വീകരിക്കുകയും ബന്ധിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.മൂന്ന് OAS-കളിൽ, OAS3, dsRNA-യോട് ഏറ്റവും ഉയർന്ന അടുപ്പം പ്രകടിപ്പിക്കുകയും, RNase L സജീവമാക്കുകയും അതുവഴി വൈറൽ റെപ്ലിക്കേഷൻ 41 പരിമിതപ്പെടുത്തുകയും ചെയ്യുന്ന 2-5 As-ന്റെ ഏറ്റവും കുറഞ്ഞ അളവ് സമന്വയിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.OAS കുടുംബത്തിൽ പോളിമറേസ് ബീറ്റ (pol-β) പോലെയുള്ള ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് ട്രാൻസ്ഫറസ് ഡൊമെയ്‌നുകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു.C-ടെർമിനൽ ഡൊമെയ്‌നിന്റെ (DIII) ഉത്തേജക പ്രവർത്തനം OAS342 സജീവമാക്കുന്നതിന് ആവശ്യമായ dsRNA-ബൈൻഡിംഗ് ഡൊമെയ്‌നിനെ (DI) ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നുവെന്ന് മുൻ ഗവേഷണങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്.OAS3-ന്റെ DI, DII ഡൊമെയ്‌നുകൾ CCDയുമായും SH2-നും STAT1 TAD-നും ഇടയിലുള്ള ഒരു ചെറിയ ജംഗ്ഷൻ മേഖലയുമായും സംവദിക്കുന്നത് ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു (ചിത്രം 4A,F).പ്രോട്ടീൻ ഘടനയിൽ വ്യത്യസ്‌ത ക്രോസ്‌ലിങ്കിംഗ് സൈറ്റുകൾ ഓവർലേ ചെയ്യുന്നത് β-ഷീറ്റും DBD STAT1 ലൂപ്പും OAS3 ന്റെ DI ഡൊമെയ്‌നിലെ (ചിത്രം 4G) 60-75 അവശിഷ്ടങ്ങളാൽ രൂപപ്പെട്ട ഒരു തുറന്ന പോക്കറ്റ് അല്ലെങ്കിൽ അറയും തമ്മിലുള്ള പ്രതിപ്രവർത്തനം വെളിപ്പെടുത്തി.സമുച്ചയത്തിലെ പ്രോട്ടീനുകളുടെ ഓറിയന്റേഷൻ സൂചിപ്പിക്കുന്നത്, OAS3 യുമായുള്ള ഇടപെടലുകളൊന്നും അതിന്റെ DI ഡൊമെയ്‌നിന്റെ (ചിത്രം. S1A) ഡിഎൻഎ-ബൈൻഡിംഗ് കഴിവിനെ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നില്ല എന്നാണ്.കൂടാതെ, GTPase MX1-ന്റെ N-ടെർമിനൽ ഡൊമെയ്‌ൻ OAS3-ന്റെ DI, DIII ഡൊമെയ്‌നുകളുമായി വിപുലമായി സംവദിക്കുന്നു (ചിത്രം 4A).മൂന്ന് IFNα- ചികിത്സിച്ച ആവർത്തനങ്ങളിലും OAS1-ഉം MX1-ഉം തമ്മിലുള്ള ഒരു ഇടപെടലും ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു, അവിടെ ഒരൊറ്റ OAS1 ഡൊമെയ്‌ൻ (ഉത്‌പ്രേരകമായി സജീവമാണ്) മൂന്ന് MX1 ഡൊമെയ്‌നുകളുമായും സംവദിച്ചു (ചിത്രം S2A,B).
ജിടിപിയെ ബന്ധിപ്പിക്കുകയും ഹൈഡ്രോലൈസ് ചെയ്യുകയും ചെയ്യുന്ന ഒരു N-ടെർമിനൽ GTPase ഡൊമെയ്‌ൻ, സ്വയം-അസംബ്ലിയിൽ മധ്യസ്ഥത വഹിക്കുന്ന ഒരു ഇന്റർമീഡിയറ്റ് ഡൊമെയ്‌ൻ, ഒരു GTPase (LZ) ആയി പ്രവർത്തിക്കുന്ന ഒരു C-ടെർമിനൽ ല്യൂസിൻ സിപ്പർ എന്നിവ അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന ഡൈനിൻ പോലുള്ള GTPases-ന്റെ ഒരു വലിയ കുടുംബത്തിന്റെ ഭാഗമാണ് MX പ്രോട്ടീനുകൾ. ).ഡൊമെയ്ൻ എഫക്റ്റർ ഡൊമെയ്ൻ25,43.വൈറൽ ജീനിന്റെ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ തടയാൻ MX1 വൈറൽ പോളിമറേസുകളുടെ ഉപയൂണിറ്റുകളുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നു43.മുമ്പ് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ട യീസ്റ്റ് ടു-ഹൈബ്രിഡ് സ്‌ക്രീൻ, PIAS1-അനുബന്ധ MX1, DNA-ബൈൻഡിംഗ് ആക്‌റ്റിവിറ്റി തടയുന്നതിലൂടെ STAT1-മെഡിയേറ്റഡ് ജീൻ ആക്റ്റിവേഷനെ തടയുന്നു, കൂടാതെ SUMO E344,45 ലിഗേസ് പ്രവർത്തനവും ഉണ്ട്.ഇവിടെ, MX1 STAT1 (ചിത്രം 4C,D) ലേക്ക് ബന്ധിപ്പിക്കുന്നു എന്ന് ഞങ്ങൾ തെളിയിക്കുന്നു, എന്നിരുന്നാലും IFNα ന് പ്രതികരണമായി ഈ ഇടപെടൽ STAT1-മധ്യസ്ഥ ജീൻ സജീവമാക്കലിനെ എങ്ങനെ ബാധിക്കുന്നു എന്നത് കൂടുതൽ പഠനം ആവശ്യമാണ്.കൂടാതെ, MX1 IFIT3, DDX60 എന്നിവയുമായി IFNα- ചികിത്സിച്ച മൂന്ന് ആവർത്തനങ്ങളിലും (ചിത്രം S2C) സംവദിച്ചതായും ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി.
DDX60 എന്നത് IFN-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് ഹെലിക്കേസാണ്, ഇത് വൈറൽ RNA46-ന്റെ RIG-I-ഇൻഡിപെൻഡന്റ് ഡിഗ്രേഡേഷനിൽ പങ്കുണ്ടെന്ന് മുമ്പ് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്.ഇത് RIG-I-മായി ഇടപഴകുകയും അതിന്റെ സിഗ്നലിംഗ് ഒരു ലിഗന്റ്-നിർദ്ദിഷ്ട രീതിയിൽ സജീവമാക്കുകയും ചെയ്യുന്നു 46. DDX60-ൽ ഒരു DEXD/H-Box ഹെലിക്കേസ് ഡൊമെയ്‌നും വൈറൽ RNA, DNA47 എന്നിവയെ ബന്ധിപ്പിക്കുന്ന ഒരു C-ടെർമിനൽ ഹെലിക്കേസ് ഡൊമെയ്‌നും അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു.MX1, IFIT3 എന്നിവയുമായുള്ള അതിന്റെ മിക്ക ഇടപെടലുകളും കാനോനിക്കൽ ഡൊമെയ്‌നുകളോ രൂപങ്ങളോ ഇല്ലാതെ നീണ്ട N-, C-ടെർമിനൽ പ്രദേശങ്ങളിൽ സംഭവിക്കുന്നു (ചിത്രം. S2E,F).എന്നിരുന്നാലും, DEXD/H-Box ഹെലിക്കേസ് ഡൊമെയ്‌നുമായി MX1 ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു (ചിത്രം. S2E).ഐഎഫ്ഐടി കുടുംബത്തിലെ പ്രോട്ടീനുകൾക്ക് ടെട്രാപെപ്റ്റൈഡ് റിപ്പീറ്റ് (ടിപിആർ) എന്ന് വിളിക്കുന്ന ഒരു വ്യതിരിക്തമായ ഹെലിക്സ്-ടേൺ-ഹെലിക്സ് മോട്ടിഫിന്റെ ടാൻഡം കോപ്പികളുണ്ട്.IFIT3 RIG-I സിഗ്നലിംഗിന്റെ പോസിറ്റീവ് മോഡുലേറ്ററാണെന്നും അതിനാൽ MAVS കോംപ്ലക്‌സിന്റെ ഒരു ഘടകമാണെന്നും കണ്ടെത്തി.ഒന്നിച്ചു നോക്കിയാൽ, IFIT3, DDX60 എന്നിവ പ്രാഥമികമായി IFIT3 യുടെ TPR 3-6 ന് ഇടയിലുള്ള പ്രദേശത്താണ് സംവദിക്കുന്നതെന്നും RIG-I/MAVS സിഗ്നലിംഗിൽ (ചിത്രം S2F) ഒരു പങ്കുവഹിക്കാമെന്നും ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
മുഴുവൻ പ്രോട്ടിയോമും സ്‌ക്രീനിംഗ് ചെയ്യുന്നത് കമ്പ്യൂട്ടേഷണൽ തീവ്രമായതിനാൽ, IFNα- ചികിത്സിച്ച ആവർത്തനങ്ങളിലൊന്നിന്റെ സാന്നിധ്യത്തിനായി ഞങ്ങൾ മുഴുവൻ മനുഷ്യ യുണിപ്രോട്ട് ഡാറ്റാബേസും സ്‌ക്രീൻ ചെയ്തു.ഈ പകർപ്പിൽ, HLA-A-യ്‌ക്കായി വളരെ വിശ്വസനീയമായ നിരവധി ഇന്ററാക്ഷൻ നെറ്റ്‌വർക്കുകൾ ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി.MS/MS സ്പെക്ട്ര തിരിച്ചറിഞ്ഞ പ്രോട്ടീൻ പാതകളുടെ വിശകലനം MHC-I അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ആന്റിജൻ പ്രോസസ്സിംഗും അവതരണവുമാണ് ഇന്റർഫെറോൺ (ചിത്രം 3D) പ്രേരിപ്പിക്കുന്ന പ്രധാന പാതയെന്ന് കാണിച്ചു.അതിനാൽ, എല്ലാ ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് സാമ്പിളുകളിലും ഉയർന്ന ആത്മവിശ്വാസത്തോടെ MHC-I തന്മാത്രകളുടെ പ്രോട്ടീൻ ഇടപെടലുകൾ പഠിക്കുന്നതിൽ ഞങ്ങൾ ശ്രദ്ധ കേന്ദ്രീകരിച്ചു.HLA-ൽ α1, α2, α3 എന്നീ ഡൊമെയ്‌നുകളും ലൈറ്റ് ചെയിനുകളും അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു, കൂടാതെ മൈക്രോഗ്ലോബുലിൻ β2 (β2m) ഒരു സ്ഥിരമായ ചാപ്പറോൺ പ്രോട്ടീൻ ആണ്.എൻഡോപ്ലാസ്മിക് റെറ്റിക്യുലത്തിൽ ഒരിക്കൽ കൂടിച്ചേർന്നാൽ, പെപ്റ്റൈഡ് ലിഗാണ്ടുകളുടെ അഭാവത്തിൽ HLA അസ്ഥിരമാണ്.പെപ്റ്റൈഡ്-ബൈൻഡിംഗ് ഗ്രോവ് രൂപപ്പെടുന്നത് ഉയർന്ന പോളിമോർഫിക്, ഘടനയില്ലാത്ത α1, α2 ഡൊമെയ്‌നുകൾ പെപ്റ്റൈഡ് ഇതര രൂപത്തിലും താരതമ്യേന കുറഞ്ഞ പോളിമോർഫിക് α351 ഡൊമെയ്‌നിലും ആണ്.IFNα യുടെ സാന്നിധ്യത്തിൽ, ഞങ്ങൾ രണ്ട് HLA-A കോംപ്ലക്സുകൾ കണ്ടെത്തി: ഒന്ന് HMGA1, H2B എന്നിവയുമായി സംവദിക്കുന്നു (ചിത്രം 5, പട്ടിക S3) മറ്റൊന്ന് MDN1, LRCH4, H2B എന്നിവയുമായി സംവദിക്കുന്നു (ചിത്രം 6).
IFNα H2B (H2BFS), HMGA1 എന്നിവയുമായി ഒരു HLA-A ഇന്ററാക്ഷൻ നെറ്റ്‌വർക്ക് ഉണ്ടാക്കുന്നു.(A) H2B-HLA-A-HMGA1 കോംപ്ലക്സിലെ വിവിധ തരത്തിലുള്ള ഇടപെടലുകളെ ചിത്രീകരിക്കുന്ന 2D പ്ലോട്ട് (സിം-എക്സ്എൽ സോഫ്റ്റ്വെയറിൽ സൃഷ്ടിച്ചത്): ഇന്റർലിങ്ക് (നീല), ഇന്റർലിങ്ക് (ചുവപ്പ്), സിംഗിൾ ലിങ്ക് (കറുപ്പ്)..വ്യത്യസ്ത ഐഡന്റിറ്റികളുടെ ഡൊമെയ്‌നുകൾ വർണ്ണ കോഡുചെയ്തിരിക്കുന്നു32: H2B (ഹിസ്റ്റോൺ; 2-102), MHC-I (MHC_1; 25-203, ഗ്രൂപ്പ് C1; 210-290, MHC_I_C; 337-364).ക്രോസ്-ലിങ്ക് ത്രെഷോൾഡ് 3.5 ആയി സജ്ജീകരിച്ചു.ഡോട്ട് പ്ലോട്ടുകൾ H2B (B), HMGA1 (C) എന്നിവയുള്ള HLA-A ഇന്ററാക്ഷൻ സൈറ്റുകളും രണ്ട് പെപ്റ്റൈഡുകൾക്കിടയിലുള്ള K അല്ലെങ്കിൽ S ഇന്ററാക്ഷൻ സൈറ്റുകളും സൂചിപ്പിക്കുന്നു.ചിത്രത്തിൽ, ക്രോസ്-ലിങ്ക് സ്കോർ ത്രെഷോൾഡ് 3.0 ആയി സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്നു.(D) PyMOL പ്രോഗ്രാമിലെ H2B, HLA-A, HMGA1 പ്രോട്ടീനുകളുടെ ഘടനയിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്ന പ്രോട്ടീനുകൾ തമ്മിലുള്ള ബന്ധം.ഈ ഘടനകൾ Phyre2 സെർവർ (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) ഉപയോഗിച്ചാണ് നിർമ്മിച്ചിരിക്കുന്നത്, കൂടാതെ H2B, HLA-A, HMGA1 പ്രോട്ടീനുകളുടെ ടെംപ്ലേറ്റ് ഘടനകൾ യഥാക്രമം 1kx552, 1kj349, 2eze55 എന്നിവയായിരുന്നു.
IFNα H2B (H2BFS), MDN1, LRCH4 എന്നിവയുമായി ഒരു HLA-A ഇന്ററാക്ഷൻ നെറ്റ്‌വർക്ക് ഉണ്ടാക്കുന്നു.(A) MDN1 ഒരു സർക്കിളായി പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന 2D ഇന്ററാക്ടീവ് മാപ്പിൽ (SIM-XL സോഫ്‌റ്റ്‌വെയറിൽ സൃഷ്‌ടിച്ചത്) ഇൻട്രാമോളികുലാർ (ചുവപ്പ്), ഇന്റർമോളിക്യുലാർ (നീല) ക്രോസ്‌ലിങ്കുകൾ.ക്രോസ്-ലിങ്ക് ത്രെഷോൾഡ് 3.5 ആയി സജ്ജീകരിച്ചു.വ്യത്യസ്ത ഐഡന്റിറ്റികളുടെ ഡൊമെയ്‌നുകൾ വർണ്ണ കോഡുചെയ്തിരിക്കുന്നു32: H2B (ഹിസ്റ്റോൺ; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, ഗ്രൂപ്പ് C1; 210–290, MHC_I_C; 337–364), LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194), CH (535–641)).(B) PyMOL പ്രോഗ്രാമിലെ H2B, HLA-A, LRCH4, MDN1 പ്രോട്ടീനുകളുടെ ഘടനയിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്ന പ്രോട്ടീനുകൾ തമ്മിലുള്ള ബന്ധം.H2B, HLA-A, LRCH4, MDN1 പ്രോട്ടീനുകൾക്കായി 1kx552, 1kj349, 6hlu62, 6i2665 എന്നീ ടെംപ്ലേറ്റ് ഘടനകളുള്ള Phyre2 സെർവർ (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) ഉപയോഗിച്ചാണ് ഈ ഘടനകൾ രൂപപ്പെടുത്തിയത്. യഥാക്രമം.H2B (C), LRCH4 (D), MDN1 (E) എന്നിവയ്‌ക്കൊപ്പം HLA-A-യ്‌ക്കായി K അല്ലെങ്കിൽ S ഇന്ററാക്ഷൻ സൈറ്റുകൾ കാണിക്കുന്ന ഡോട്ട് പ്ലോട്ടുകൾ.പ്ലോട്ടുകൾക്ക്, ക്രോസ്-ലിങ്ക് സ്കോർ ത്രെഷോൾഡ് 3.0 ആയി സജ്ജീകരിച്ചു.
ജീനോമിന്റെ സമഗ്രത നിലനിർത്തുന്നതിനു പുറമേ, ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷന്റെ നിയന്ത്രണത്തിലും ഹിസ്റ്റോൺ H2B ഉൾപ്പെടുന്നു.H2B പ്രോട്ടീനിൽ മൂന്ന് α-ഹെലിസുകൾ ലൂപ്പുകളാൽ വേർതിരിച്ച ഒരു സെൻട്രൽ ഹിസ്റ്റോൺ ഡൊമെയ്‌നും (HFD) ഒരു C-ടെർമിനൽ ടെയിൽ 41,52 ഉം അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു.H2B-യുമായുള്ള മിക്ക ഇടപെടലുകളും α1 ഹെലിക്സിലാണ് സംഭവിക്കുന്നത്, ഇത് HFD ഹെറ്ററോഡൈമർ (ചിത്രം 5A,B) ഉപയോഗിച്ച് ട്രൈമറൈസേഷൻ നൽകുന്നു.ലൈസിനുകൾ ഡിഎൻഎ ബൈൻഡിംഗിൽ ഉൾപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെങ്കിലും, ചില ലൈസിനുകൾ ഇതര അസറ്റൈലേഷൻ അല്ലെങ്കിൽ മെഥിലേഷൻ സൈറ്റുകളാണ്.ഉദാഹരണത്തിന്, H2B-യിൽ നിന്നുള്ള K43, K46, K57 എന്നിവയുടെ അവശിഷ്ടങ്ങൾ നേരിട്ട് DNA ബൈൻഡിംഗിൽ ഉൾപ്പെട്ടിട്ടില്ല, എന്നാൽ അവ വിവിധ പോസ്റ്റ്-ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനൽ പരിഷ്ക്കരണങ്ങളുടെ ലക്ഷ്യങ്ങളാണ്.അതുപോലെ, H2B-യിലെ അവശിഷ്ടങ്ങൾ K44, K47, K57 എന്നിവ മറ്റ് പ്രോട്ടീനുകളുമായുള്ള ഇടപെടലുകൾ ഉൾപ്പെടെ IFNα യുടെ സാന്നിധ്യത്തിൽ ഒരു ബദൽ പങ്ക് വഹിച്ചേക്കാം (ചിത്രം 5A, B).കൂടാതെ, എക്സ്ട്രാക്രോമസോമൽ ഹിസ്റ്റോൺ എച്ച് 2 ബി വിവിധ കോശ തരങ്ങളിൽ രോഗപ്രതിരോധ പ്രതികരണത്തെ സജീവമാക്കുന്നു, പകർച്ചവ്യാധികളിൽ നിന്നോ കേടായ കോശങ്ങളിൽ നിന്നോ ഉരുത്തിരിഞ്ഞ ഡബിൾ സ്ട്രാൻഡഡ് ഡിഎൻഎ (ഡിഎസ്ഡിഎൻഎ) ശകലങ്ങൾ കണ്ടെത്തുന്നതിനുള്ള സൈറ്റോസോളിക് സെൻസറായി പ്രവർത്തിക്കുന്നു.DNA വൈറസുകളുടെ സാന്നിധ്യത്തിൽ, H2B ശോഷണം IFN-β ഉൽപ്പാദനത്തെയും STAT154 ഫോസ്ഫോറിലേഷനെയും തടഞ്ഞു.H2B മറ്റ് കോർ ഹിസ്റ്റോണുകളേക്കാൾ വേഗത്തിൽ ന്യൂക്ലിയസിനുള്ളിലേക്കും പുറത്തേക്കും നീങ്ങുന്നതായി അറിയപ്പെടുന്നു54.തിരഞ്ഞെടുത്ത ചികിത്സയില്ലാത്ത സാമ്പിളുകളിൽ MDN1, LRCH4 എന്നിവയുമായുള്ള H2B ഇടപെടലുകളും നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു.IFNα- ചികിത്സിച്ച മൂന്ന് സാമ്പിളുകളിലും ചികിത്സിക്കാത്ത ഒരു ആവർത്തന സാമ്പിളിലും HLA-A H2B-യുമായി സംവദിച്ചതായി ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി.ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ റെഗുലേഷനിൽ നിന്ന് സ്വതന്ത്രമായ ഒരു ബദൽ ഫിസിയോളജിക്കൽ ഫംഗ്ഷനിൽ H2B യുടെ പങ്ക് ഈ ഡാറ്റ പ്രതിഫലിപ്പിക്കുന്നു.
എച്ച്എംജിഎ1 (ഹൈ മൊബിലിറ്റി ഗ്രൂപ്പ് എടി-ഹുക്ക് 1), രോഗത്തെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്ന അമിനോ ആസിഡുകളാൽ സമ്പന്നമായ ഒരു ചെറിയ ന്യൂക്ലിയോപ്രോട്ടീൻ, എച്ച്എൽഎ-എയുമായി ചേർന്ന് തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുണ്ട്.ഇതിന് ഒരു അസിഡിറ്റി ഉള്ള C-ടെർമിനൽ ടെയിൽ ഉണ്ട്, AT ഹുക്കുകൾ എന്ന് വിളിക്കപ്പെടുന്ന മൂന്ന് വ്യത്യസ്ത DBD-കൾ dsDNA55,56-ലെ എടി-സമ്പന്നമായ പ്രദേശത്തിന്റെ മൈനർ ഗ്രോവുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നു.ഈ ബൈൻഡിംഗ് ഡിഎൻഎയെ വളയുകയോ നേരെയാക്കുകയോ ചെയ്യുന്നു, കാനോനിക്കൽ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകങ്ങളെ അതിന്റെ സമവായ ക്രമം ആക്സസ് ചെയ്യാൻ അനുവദിക്കുന്നു.പ്രോട്ടീൻ-പ്രോട്ടീൻ ഇടപെടലുകളിലും ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഘടകങ്ങളുടെ റിക്രൂട്ട്മെന്റിലും സി-ടെർമിനൽ ടെയിൽ ഉൾപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെന്ന് വിശ്വസിക്കപ്പെടുന്നു, കാരണം സി-ടെർമിനൽ ഡിലീഷൻ മ്യൂട്ടന്റുകൾക്ക് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ആരംഭിക്കാൻ കഴിയില്ല.മാത്രമല്ല, ഈ ഡൊമെയ്‌നിൽ നിരവധി സംരക്ഷിത ഫോസ്‌ഫോറിലേഷൻ സൈറ്റുകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു, അവ കൈനാസുകൾ 58-ന്റെ അടിവസ്ത്രങ്ങൾ എന്ന് അറിയപ്പെടുന്നു.C-ടെർമിനൽ ഡൊമെയ്‌നിന് പുറത്ത് HMGA1-മായി HLA-A, H2B ഇടപെടലുകൾ ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു, സി-ടെർമിനൽ ഡൊമെയ്‌ൻ പ്രധാനമായും ട്രാൻസ്‌ക്രിപ്ഷൻ ഫാക്ടർ ബൈൻഡിംഗിനാണ് ഉപയോഗിക്കുന്നതെന്ന് നിർദ്ദേശിക്കുന്നു (ചിത്രം 5A, C).HMGA പ്രോട്ടീനുകൾ അഡാപ്റ്റർ ഡിഎൻഎയുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് ഹിസ്റ്റോൺ H1-മായി മത്സരിക്കുന്നു, അതുവഴി പ്രവേശനക്ഷമത വർദ്ധിക്കുന്നു.അതുപോലെ, ഹിസ്റ്റോൺ H1-നുമായുള്ള മത്സരത്തിൽ HMGA ഡിഎൻഎ ലിങ്കർ ഉപയോഗിച്ച് ഹിസ്റ്റോൺ H2B-യുമായി സംവദിക്കാൻ സാധ്യതയുണ്ട്.HMGB1, ഡെൻഡ്രിറ്റിക് സെല്ലുകളിൽ HLA-A, -B, -C എന്നിവയുടെ പ്രകടനത്തെ പ്രേരിപ്പിക്കുന്നു, ഇത് അവയുടെ സജീവമാക്കലിലേക്ക് നയിക്കുന്നു.HLA-A-യുടെ α1, α3 ഡൊമെയ്‌നുകളുമായി HMGA1 സംവദിക്കുന്നതായി ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി, അതിന്റെ 3 DBD ന് പുറത്തുള്ള മിക്ക ഇടപെടലുകളും (ചിത്രം 5A,C).ഞങ്ങളുടെ കൈകളിൽ, HLA-A ന്യൂക്ലിയസിൽ പ്രാദേശികവൽക്കരിക്കപ്പെട്ടതായി കണ്ടെത്തി (ഡാറ്റ കാണിച്ചിട്ടില്ല), കൂടാതെ H2B, HMGA1 എന്നിവയും ന്യൂക്ലിയസിൽ ഉള്ളതിനാൽ, ഈ പ്രതിപ്രവർത്തനം ന്യൂക്ലിയസിൽ സംഭവിക്കാം.H2B, HLA-A, HMGA1 എന്നിവയ്‌ക്കിടയിൽ അളക്കുന്ന പ്രത്യേക അഡക്‌റ്റുകൾ ചിത്രം 5D-ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.
മറ്റ് പ്രോട്ടീനുകളുമായുള്ള HLA-A യുടെ മിക്ക ഇടപെടലുകളും അതിന്റെ α1, α2 ഡൊമെയ്‌നുകളിലും ക്രമരഹിതമായ C-ടെർമിനൽ ഡൊമെയ്‌നിലും സംഭവിക്കുന്നു (ചിത്രം 6).ഈ ഉദാഹരണങ്ങളിലൊന്നിൽ, LRCH4-ന്റെ ക്രമരഹിതമായ N-ടെർമിനൽ ടെയിലുമായി HLA-A ഇടപെടുന്നതായി ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (ചിത്രം 6A,D).LRCH4 TLR4 ആക്റ്റിവേഷനും LPS സൈറ്റോകൈൻ ഇൻഡക്ഷനും നിയന്ത്രിക്കുന്നു, അതുവഴി സഹജമായ രോഗപ്രതിരോധ പ്രതികരണം മോഡുലേറ്റ് ചെയ്യുന്നു60,61.ഒമ്പത് ല്യൂസിൻ-റിച്ച് റിപ്പീറ്റുകളും (LRRs) ഒരു മെംബ്രൻ പ്രോട്ടീനും അതിന്റെ എക്ടോഡോമെയ്‌നിലെ ഒരു കോളമോഡുലിൻ (CH) ഹോമോളജി മോട്ടിഫും, തുടർന്ന് ഒരു ട്രാൻസ്‌മെംബ്രൺ ഡൊമെയ്‌നും (TMD) 60 , 62 .CH ഡൊമെയ്‌നുകൾ പ്രോട്ടീൻ-പ്രോട്ടീൻ ഇടപെടലുകളെ മധ്യസ്ഥമാക്കുന്നതായി റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട് 60 .LRR, CH ഡൊമെയ്‌നുകൾക്കിടയിലുള്ള ഏകദേശം 300 അമിനോ ആസിഡുകൾ താരതമ്യേന ആക്‌സസ് ചെയ്യാവുന്നതും എന്നാൽ ക്രമരഹിതവുമാണ്.പ്രോട്ടീൻ-പ്രോട്ടീൻ നെറ്റ്‌വർക്കുകളുടെയും വെസിക്കുലാർ ട്രാൻസ്‌പോർട്ട് 63 ന്റെയും മധ്യസ്ഥർ എന്ന നിലയിൽ ക്രമരഹിതമായ പ്രദേശങ്ങളുടെ പ്രവർത്തനത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കി, മിക്ക പ്രോട്ടീൻ ഇടപെടലുകളും ക്രമരഹിതമായ പ്രദേശങ്ങളിൽ സംഭവിക്കുന്നതായി ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി.LRR1, LRR6, CH ഡൊമെയ്‌നുകൾ, ക്രമരഹിതമായ പ്രദേശങ്ങൾ എന്നിവയുൾപ്പെടെ MDN1-യുമായുള്ള ഇടപെടലുകൾ പ്രോട്ടീന്റെ ദൈർഘ്യത്തിലുടനീളം വിതരണം ചെയ്യപ്പെട്ടു, അതേസമയം H2B പ്രധാനമായും CH ഡൊമെയ്‌നുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു (ചിത്രം 6A, B).ശ്രദ്ധേയമായി, CLMS സമീപനത്തിന്റെ പ്രത്യേകതയെ സൂചിപ്പിക്കുന്ന TMJ ഇടപെടലുകളൊന്നും ഉൾപ്പെട്ടിരുന്നില്ല (ചിത്രം 6A, B).
HLA-A പ്രോട്ടീൻ നെറ്റ്‌വർക്കിന്റെ ഭാഗമായി MDN1 തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുണ്ട് (ചിത്രം 6A).ഇത് പ്രോട്ടീനുകളുടെ AAA കുടുംബത്തിൽ പെടുന്നു (വിവിധ പ്രവർത്തനങ്ങളുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ATPases).ഇതേ N-ടെർമിനൽ AAA ഡൊമെയ്‌നാണ് ഒരു ഹെക്‌സാമെറിക് റിംഗ് ആയി ക്രമീകരിക്കുകയും 60S 64 റൈബോസോമൽ ഉപയൂണിറ്റിൽ നിന്ന് അസംബ്ലി ഘടകം നീക്കം ചെയ്യുകയും ചെയ്യുന്നത്.dynein64,65,66 ന് സമാനമാണ്.കൂടാതെ, Asp/Glu സമ്പന്നമായ മേഖലയെ MIDAS ഡൊമെയ്‌ൻ പിന്തുടരുന്നു (മെറ്റൽ അയോൺ ആശ്രിത സൈറ്റ്).MDN1 ന്റെ വലിയ വലിപ്പവും (ഏകദേശം 5600 അമിനോ ആസിഡുകൾ) നന്നായി പഠിച്ച പ്രോട്ടീനുകളുള്ള അതിന്റെ പരിമിതമായ ഹോമോളജിയും കാരണം, മനുഷ്യരിൽ അതിന്റെ ഘടനയെയും പ്രവർത്തനത്തെയും കുറിച്ച് വളരെക്കുറച്ചേ അറിയൂ.ഞങ്ങൾ HLA-A, H2B, LRCH4 എന്നിവയെ MDN1 ബൈൻഡിംഗ് പങ്കാളികളായി തിരിച്ചറിഞ്ഞു, PyMol-ലെ പ്രോട്ടീൻ കോംപ്ലക്സുകളായി അവയുടെ ഓറിയന്റേഷൻ വെളിപ്പെടുത്തി (ചിത്രം 6A,B).ഈ മൂന്ന് പ്രോട്ടീനുകളും AAA ഡൊമെയ്‌നുമായി സംവദിക്കുന്നു, ഡൈനിൻ പോലുള്ള ലിങ്കർ ഡൊമെയ്‌ൻ, ഒരുപക്ഷേ MIDAS MDN1 ഡൊമെയ്‌ൻ.മുമ്പത്തെ റിപ്പോർട്ടിൽ, ബെയ്റ്റ് പ്രോട്ടീനുകളുടെ അഫിനിറ്റി പ്യൂരിഫിക്കേഷൻ MDN1 ഹിസ്റ്റോൺ H2B67 മായി ബന്ധപ്പെട്ട ഒരു പ്രോട്ടീനായി തിരിച്ചറിഞ്ഞു.കൂടാതെ, ഞങ്ങളുടെ കണ്ടെത്തലുകളെ പിന്തുണയ്ക്കുന്ന അഫിനിറ്റി-പ്യൂരിഫൈഡ് മാസ്സ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി ഉപയോഗിച്ച് HCT116 സെല്ലുകളിൽ MDN-ഉം HLA-B-യും തമ്മിലുള്ള ഒരു ഇടപെടലും സമീപകാല പഠനം റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തു.IFNα- ചികിത്സിച്ച സാമ്പിളുകളിലെ ഈ സമുച്ചയത്തിന്റെ തിരിച്ചറിയൽ ഇന്റർഫെറോൺ സിഗ്നലിംഗിൽ MDN1-ന്റെ പങ്ക് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
HLA ജീനുകൾ ഉയർന്ന പോളിമോർഫിക് ആയതിനാൽ, Flo-1 സെല്ലുകളുടെ RNA സീക്വൻസിംഗ് ഡാറ്റയിൽ നിന്ന് HLA-A, -B, and -C മാപ്പിംഗ് സീക്വൻസിങ് റീഡുകൾ ഞങ്ങൾ എക്‌സ്‌ട്രാക്‌റ്റുചെയ്‌തു (ഡാറ്റ കാണിച്ചിട്ടില്ല).എച്ച്എൽഎ-എയിൽ ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് പെപ്റ്റൈഡുകൾ സ്ഥിതി ചെയ്യുന്ന പ്രദേശങ്ങളിൽ എച്ച്എൽഎ-എ, -ബി, -സി എന്നിവ തമ്മിലുള്ള കാര്യമായ വ്യത്യാസങ്ങൾ സീക്വൻസിംഗ് റീഡിംഗുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്ന പെപ്റ്റൈഡ് സീക്വൻസുകൾ വെളിപ്പെടുത്തി (ചിത്രം എസ് 3).കൂടാതെ, H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 പ്രോട്ടീനുകളുള്ള HLA-B/C തന്മാത്രകളുടെ പ്രോട്ടീൻ-ടു-പ്രോട്ടീൻ ക്രോസ്-ലിങ്കിംഗ് ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചില്ല.HLA-A, MDN1, LRCH1, HMGA1 എന്നിവയ്ക്കിടയിലുള്ള പ്രോട്ടീൻ പ്രതിപ്രവർത്തനം HLA-A സ്പെസിഫിക് ആണെന്ന് ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.കൂടാതെ, ക്രോസ്‌ലിങ്ക് ചെയ്യാത്ത സാമ്പിളുകളുടെ പ്രോട്ടോമിക് വിശകലനം (ടേബിൾ എസ് 4) കാണിക്കുന്നത് എച്ച്‌എൽ‌എ-ബി അല്ലെങ്കിൽ എച്ച്‌എൽ‌എ-സിയുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ എച്ച്‌എൽ‌എ-എയ്ക്ക് ഉയർന്ന സീക്വൻസ് കവറേജ് ഉണ്ടെന്നാണ്.IFNα- ചികിത്സിച്ചതും ചികിത്സിക്കാത്തതുമായ സാമ്പിളുകളിൽ HLA-A-യ്‌ക്കായി തിരിച്ചറിഞ്ഞ പെപ്റ്റൈഡുകൾ ഉയർന്ന തീവ്രതയുള്ളവയാണ്.
ഇവിടെ തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുള്ള ഇടപെടലുകൾ സ്പേഷ്യൽ പ്രോക്‌സിമിറ്റിയിലുള്ള രണ്ട് പ്രോട്ടീനുകളുടെ നിർദ്ദിഷ്ട ക്രോസ്-ലിങ്കിംഗ് മൂലമല്ലെന്ന് ഉറപ്പാക്കാൻ, കോ-ഇമ്മ്യൂണോപ്രെസിപിറ്റേഷൻ അസെകൾ നടത്തി രണ്ട് പുതിയ HLA-A സംവേദനാത്മക ഘടകങ്ങൾ ഞങ്ങൾ സ്ഥിരീകരിച്ചു.എൻഡോജെനസ് MDN1, H2B എന്നിവയുമായുള്ള HLA-A ഇടപെടലുകൾ IFNα- ചികിത്സിച്ചതും ചികിത്സിക്കാത്തതുമായ Flo-1 സെല്ലുകളിൽ കണ്ടെത്തി (ചിത്രം 7, ചിത്രം S4).ഇമ്മ്യൂണോപ്രിസിപിറ്റേറ്റുകളിൽ എച്ച്എൽഎ-എ എച്ച് 2 ബി പിടിച്ചെടുത്തുവെന്നും ചികിത്സിക്കാത്ത സെല്ലുകളിൽ നിന്നുള്ള ഇമ്മ്യൂണോപ്രിസിപിറ്റേറ്റ് സാമ്പിളുകളിൽ എച്ച്എൽഎ-എ ഇല്ലാതിരുന്നതിനാൽ ഐഎഫ്എൻα ചികിത്സ മൂലമാണ് ഈ ബന്ധം ഉണ്ടായതെന്നും ഞങ്ങൾ സ്ഥിരീകരിച്ചു (ചിത്രം 7 എ).എന്നിരുന്നാലും, H2B, MDN1 എന്നിവയുമായി HLA-A ബൈൻഡിംഗിനെ IFNα വ്യത്യസ്തമായി നിയന്ത്രിക്കുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.IFNα H2B-യും HLA-A-യും തമ്മിലുള്ള ബന്ധത്തെ പ്രേരിപ്പിക്കുന്നു, എന്നാൽ MDN1-യുമായുള്ള ബന്ധം കുറയ്ക്കുന്നു.നിയന്ത്രണങ്ങളിൽ MDN1 HLA-A-മായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി, കൂടാതെ IFNα യുടെ കൂട്ടിച്ചേർക്കൽ IFNα വഴിയുള്ള MDN1 ഇൻഡക്ഷനിൽ നിന്ന് സ്വതന്ത്രമായി ഈ ഇടപെടൽ കുറയ്ക്കുന്നു (ചിത്രം 7B,C).കൂടാതെ, HLA-A immunoprecipitation A549 സെല്ലുകളിൽ H2B പിടിച്ചെടുത്തു (ചിത്രം. S4), ഈ പ്രതിപ്രവർത്തനം സെൽ തരത്തിൽ നിന്ന് സ്വതന്ത്രമാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.ഒരുമിച്ച് എടുത്താൽ, ഈ ഫലങ്ങൾ H2B, MDN1 എന്നിവയുമായുള്ള HLA-A-യുടെ ഇന്റർഫെറോൺ-മധ്യസ്ഥ ഇടപെടലുകളെ പിന്തുണയ്ക്കുന്നു.
HLA-A H2B, MDN1 എന്നിവയെ സഹ-ശുദ്ധീകരിക്കുന്നു.IFNα- ചികിത്സിച്ച Flo-1 സെല്ലുകളിൽ നിന്ന് പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന എൻഡോജെനസ് H2B (A), MDN1 (B) ഇമ്മ്യൂണോബ്ലോട്ടുകൾ ഇമ്മ്യൂണോപ്രെസിപിറ്റേറ്റ് ചെയ്യുകയും സൂചിപ്പിച്ച ആന്റിബോഡികൾക്കായി അന്വേഷണം നടത്തുകയും ചെയ്തു.എലിയും മുയൽ ഐജിജിയും നെഗറ്റീവ് നിയന്ത്രണമായി ഉപയോഗിച്ചു.(സി) വിവിധ ആന്റിജനുകളുടെ ആപേക്ഷിക അളവുകൾ (ഇൻപുട്ട്) സൂചിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന ആന്റിബോഡികൾക്കെതിരെയുള്ള ഇമ്യൂണോബ്ലോട്ടുകൾ ചിത്രീകരിക്കുന്നു, β- ആക്റ്റിൻ ഒരു ലോഡിംഗ് നിയന്ത്രണമായി ഉപയോഗിച്ചു.
ഇന്റർഫെറോൺ-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് വളരെ വിശ്വസനീയമായ ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് നെറ്റ്‌വർക്കുകളിൽ ഒന്നായ H2B-HLA-A-HMGA1-ന്റെ ഘടനാപരമായ സവിശേഷതകൾ അന്വേഷിച്ചു.ഈ സമുച്ചയത്തിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന പ്രോട്ടീനുകളുടെ അനുരൂപമായ ചലനാത്മകത മനസ്സിലാക്കുന്നതിനുള്ള ഒരു ബദൽ സമീപനമായി ഞങ്ങൾ മോളിക്യുലാർ ഡൈനാമിക്സ് മോഡലിംഗ് ഉപയോഗിച്ചു (ചിത്രം 8).CLMS ഡാറ്റയിൽ നിന്നുള്ള അനുമാനങ്ങൾ H2B, HLA-A, HMGA1 പ്രോട്ടീനുകളുടെ വ്യത്യസ്ത അനുരൂപീകരണങ്ങളുടെ സാധ്യതയെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.അതിനാൽ, ഇനിപ്പറയുന്ന പൊട്ടൻഷ്യൽ കോംപ്ലക്സുകൾ ഒരു ലായക മാധ്യമത്തിൽ മാതൃകയാക്കി: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A, H2B-HLA-A-HMGA1.MOE (മോളിക്യുലർ ഓപ്പറേറ്റിംഗ് എൻവയോൺമെന്റ്; കെമിക്കൽ കമ്പ്യൂട്ടിംഗ് ഗ്രൂപ്പ് ഇൻക്., മോൺട്രിയൽ, ക്യൂബെക്ക്, കാനഡ) പാക്കേജ് ഉപയോഗിച്ചുള്ള ഒരു പ്രാരംഭ പ്രോട്ടീൻ-പ്രോട്ടീൻ ഡോക്കിംഗ് സ്ക്രീൻ ഈ പ്രോട്ടീനുകൾക്കിടയിൽ വ്യത്യാസമുള്ള സാധ്യമായ അനുരൂപങ്ങൾ നിർദ്ദേശിച്ചു (ചിത്രം 8A).ഡോക്കിംഗ് പ്രോട്ടീൻ സമുച്ചയത്തിന്റെ ദൃശ്യവൽക്കരണം നിരവധി ഇടപെടലുകളും സാധ്യമായ അനുരൂപങ്ങളും വെളിപ്പെടുത്തി (ചിത്രം 5A, 8).അങ്ങനെ, സാധ്യമായ ഒരു കൺഫർമേഷൻ ചിത്രം 8A-ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു (ലേബൽ ചെയ്ത ക്രോസ്-ലിങ്കുകൾക്കൊപ്പം) അത് എംഡി മോഡലിംഗ് പൈപ്പ്ലൈൻ ഉപയോഗിച്ച് കൂടുതൽ വിലയിരുത്തി.കൂടാതെ, H2B അല്ലെങ്കിൽ HMGA1-നെ HLA-A-യുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നത് HLA-A-യുമായി H2B-യുടെ ഉയർന്ന അടുപ്പം എടുത്തുകാണിക്കുന്നു (ചിത്രം 8A).
H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A, H2B-HLA-A-HMGA1 കോംപ്ലക്സുകൾ എന്നിവയ്ക്കിടയിലുള്ള സാധ്യമായ നെറ്റ്‌വർക്കുകളുടെ കൺഫർമേഷൻ ഡൈനാമിക്സ്.(A) ഇൻട്രാമോളികുലാർ (ചുവപ്പ്), ഇന്റർമോളിക്യുലാർ (നീല) ക്രോസ്‌ലിങ്കുകളുടെ (ക്രോസ്‌ലിങ്ക് കട്ട്ഓഫ് 3.5 ആയി സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്നു) 2D മാപ്പാണ് (SIM-XL സോഫ്‌റ്റ്‌വെയറിൽ സൃഷ്‌ടിച്ചത്) ഇടത് പാനൽ.കൂടാതെ, തിരിച്ചറിഞ്ഞ ക്രോസ്-ലിങ്കിംഗ് അവശിഷ്ടങ്ങൾ H2B, HLA-A, HMGA1 പ്രോട്ടീനുകളുടെ ഘടനയിൽ ലേബൽ ചെയ്തിരിക്കുന്നു.MOE പാക്കേജിൽ നടപ്പിലാക്കിയ ഡോക്കിംഗ് പൈപ്പ്ലൈൻ ഉപയോഗിച്ച് ഈ പ്രോട്ടീനുകളുടെ അനുബന്ധ അനുരൂപങ്ങൾ വേർതിരിച്ചെടുത്തു.വ്യത്യസ്‌ത പ്രോട്ടീൻ-പ്രോട്ടീൻ ബൈൻഡിംഗ് അഫിനിറ്റികളുള്ള (GBVI/WSA dG; kcal/mol) H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A കോംപ്ലക്സുകളുടെ സാധ്യമായ വിവിധ കോൺഫോർമേഷനുകൾ താഴെ ഇടത് പാനൽ കാണിക്കുന്നു.(ബി) ഓരോ പ്രോട്ടീൻ ഘടനയ്ക്കും ആറ്റോമിക് സ്ഥാനങ്ങളുടെ (ഹൈഡ്രജൻ ആറ്റങ്ങൾ ഒഴികെ) സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷൻ (RMSD).(C) ≥10 ns ദൈർഘ്യമുള്ള പ്രത്യേക ഇടപെടലുകൾ പരിഗണിച്ച് വിവിധ സിമുലേറ്റഡ് കോംപ്ലക്സുകളിൽ നിന്നുള്ള ഇന്റർമോളിക്യുലാർ പ്രോട്ടീൻ-പ്രോട്ടീൻ ഹൈഡ്രജൻ ബോണ്ട് ഇടപെടലുകൾ.എച്ച്-ബോണ്ട് ഡോണർ-അക്സെപ്റ്റർ കട്ട്ഓഫ് ദൂരം 3.5 Å ആയും ഡോണർ-എച്ച്-അക്സെപ്റ്റർ കട്ട്ഓഫ് ആംഗിൾ ≥ 160°–180° ആയും സജ്ജീകരിച്ചു.(D) ഡമ്മി HLA-A-H2B, HLA-A-HMGA1 കോംപ്ലക്സുകളിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത ≥20 ns വരെ വ്യാപിച്ചുകിടക്കുന്ന HLA-A പ്രോട്ടീൻ-പ്രോട്ടീൻ ഇടപെടലുകൾ ഉണ്ടാക്കുന്ന ലേബൽ ചെയ്ത അവശിഷ്ടങ്ങൾ.പ്രോട്ടീൻ ഘടനകൾ ശരാശരി 100 ns MDS ഘടനയെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.(E) HLA-A-H2B, HLA-A-HMGA1 കോംപ്ലക്സുകൾ തമ്മിലുള്ള ഇടപെടലുകൾ, രണ്ട് പെപ്റ്റൈഡുകൾ തമ്മിലുള്ള കെ അല്ലെങ്കിൽ എസ് ഇന്ററാക്ഷൻ സൈറ്റിനെ അടിസ്ഥാനമാക്കി 100 ns-ൽ കൂടുതൽ H2B-HLA സിമുലേഷൻ ട്രാക്ക് ചെയ്യുന്ന ഇടപെടലുകളെ അപേക്ഷിച്ച്.കോംപ്ലക്സുകൾ /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.ക്രോസ്-ലിങ്കുകളുടെ മൂല്യനിർണ്ണയത്തിനുള്ള ത്രെഷോൾഡ് മൂല്യം 3.0 ആയി സജ്ജീകരിച്ചു, കൂടാതെ ≥ 10 ns എടുക്കുന്ന MDS-ൽ നിന്നുള്ള പ്രത്യേക ഇടപെടലുകൾ കണക്കിലെടുക്കുകയും ചെയ്തു.BIOVIA ഡിസ്കവറി സ്റ്റുഡിയോ (Dassault Systemes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA), മോളിക്യുലർ ഓപ്പറേറ്റിംഗ് എൻവയോൺമെന്റ് (MOE; കെമിക്കൽ കമ്പ്യൂട്ടിംഗ് ഗ്രൂപ്പ് Inc., Montreal, Quebec, Canada) പാക്കേജുകൾ ഉപയോഗിച്ച് പ്രോട്ടീൻ ഘടനകൾ ദൃശ്യവൽക്കരിച്ചു.
കാലക്രമേണ HLA-A തന്മാത്രകളുടെ സ്ഥിരത (സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷൻ; RMSD അല്ലെങ്കിൽ സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷൻ; RMSF) കോംപ്ലക്സുകളിലെ H2B അല്ലെങ്കിൽ HMGA1 പ്രോട്ടീനുകളുടെ സാന്നിധ്യം HLA-A-യെ സ്ഥിരപ്പെടുത്തുന്നതായി സൂചിപ്പിച്ചു (ചിത്രം 8B, ചിത്രം S5).HMGA1 പ്രോട്ടീൻ HLA-A-യുടെ B2M സൈറ്റുമായി ദൃഢമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നു, HLA-A-HMGA1 അല്ലെങ്കിൽ H2B-HLA-A-HMGA1 കോംപ്ലക്സിലെ HLA-A അമിനോ ആസിഡുകളുടെ സ്ഥിരതയെ പ്രേരിപ്പിക്കുന്നു (ചിത്രം 8B, ചിത്രം S5).പ്രത്യേകിച്ചും, HLA അവശിഷ്ടങ്ങൾ ~60-90, ~180-210 എന്നിവ H2B യുടെ സാന്നിധ്യത്തിൽ കുറഞ്ഞ വഴക്കമുള്ളതായി കണ്ടെത്തി (FIG. 8B).H2B, HMGA1 എന്നിവ H2B-HLA-A-HMGA1 സമുച്ചയത്തിൽ HLA-A-യുമായി H2B അല്ലെങ്കിൽ HMGA1-ലേക്ക് മാത്രം ബൈൻഡിംഗ് ചെയ്യുന്നതിനെ അപേക്ഷിച്ച് HLA-A-യുമായി മികച്ച ബന്ധം കാണിക്കുന്നു (ചിത്രം 8C,D; പട്ടിക S5).ഹൈഡ്രജൻ ബോണ്ടിംഗിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന അവശിഷ്ടങ്ങൾ (MD മോഡൽ ഹൈ ഒക്യുപൻസി ≥ 10 ns) സമുച്ചയത്തിലെ CLMS ഇന്ററാക്ഷൻ സൈറ്റുകളുമായി (K അല്ലെങ്കിൽ S അവശിഷ്ടങ്ങൾ) ഒത്തുചേരുന്നു, ഇത് CLMS തിരിച്ചറിഞ്ഞ ഇടപെടലുകൾ വളരെ വിശ്വസനീയമാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.വിശ്വാസ്യത (ചിത്രം 8E ).CLMS, MD മോഡലിംഗിൽ, ഏകദേശം 190-210 നും ഏകദേശം 200-220 നും ഇടയിലുള്ള HLA-A അവശിഷ്ടങ്ങൾ യഥാക്രമം H2B, HMGA1 എന്നിവയെ ബന്ധിപ്പിക്കുന്നതായി കണ്ടെത്തി (FIG. 8E).
പ്രോട്ടീൻ-പ്രോട്ടീൻ ഇടപെടലുകൾ ചില ഉദ്ദീപനങ്ങളോടുള്ള പ്രതികരണമായി ഇൻട്രാ സെല്ലുലാർ ആശയവിനിമയത്തിന് മധ്യസ്ഥത വഹിക്കുന്ന ചലനാത്മക ഘടനാപരമായ ശൃംഖലകൾ ഉണ്ടാക്കുന്നു.പല പ്രോട്ടിയോമിക്‌സ് സമീപനങ്ങളും പ്രോട്ടീന്റെ മൊത്തത്തിലുള്ള സ്ഥിരമായ നിലയിലെ മാറ്റങ്ങൾ കണ്ടെത്തുന്നതിനാൽ, പ്രോട്ടീൻ-പ്രോട്ടീൻ ഇന്ററാക്ഷൻ ഡൈനാമിക്‌സിന് ബൈൻഡിംഗ് ഇന്റർഫേസുകൾ ക്യാപ്‌ചർ ചെയ്യുന്നതിന് അധിക ഉപകരണങ്ങൾ ആവശ്യമാണ്, കൂടാതെ CLMS അത്തരത്തിലുള്ള ഒന്നാണ്.ഇന്റർഫെറോൺ സിഗ്നലിംഗ് സിസ്റ്റം ഒരു സൈറ്റോകൈൻ ശൃംഖലയാണ്, ഇത് പാരിസ്ഥിതിക രോഗകാരിയും ആന്തരികവുമായ പാത്തോളജിക്കൽ സിഗ്നലുകളോട് പ്രതികരിക്കാൻ കോശങ്ങളെ അനുവദിക്കുന്നു, ഇത് ഇന്റർഫെറോൺ-ഇൻഡ്യൂസിബിൾ പ്രോട്ടീനുകളുടെ ഉപവിഭാഗങ്ങളുടെ ഇൻഡക്ഷനിൽ അവസാനിക്കുന്നു.ഇന്റർഫെറോൺ-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് പ്രോട്ടീനുകളുടെ ഒരു പാനലിൽ പുതിയ പ്രോട്ടീൻ-പ്രോട്ടീൻ ഇടപെടലുകൾ തിരിച്ചറിയാൻ കഴിയുമോ എന്ന് നിർണ്ണയിക്കാൻ ഞങ്ങൾ CLMS പ്രയോഗിച്ചു.പ്രോട്ടീൻ കോംപ്ലക്സുകൾ പിടിച്ചെടുക്കാൻ ഇന്റർഫെറോൺ-റെസ്പോൺസീവ് ഫ്ലോ-1 സെൽ മോഡലിൽ ഗ്ലോബൽ പ്രോട്ടീൻ ക്രോസ്-ലിങ്കിംഗ് വിശകലനം ഉപയോഗിച്ചു.നോൺ-ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ്, ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് സെല്ലുകളിൽ നിന്ന് ട്രൈപ്റ്റിക് പെപ്റ്റൈഡുകൾ വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്നത് പെപ്റ്റൈഡ് കൗണ്ടിംഗ്, പാത്ത്വേ സമ്പുഷ്ടമാക്കൽ, പെപ്റ്റൈഡ് ദൈർഘ്യം എന്നിവ നിർവചിക്കപ്പെട്ട LFQ തീവ്രതയോടെ അനുവദിക്കുന്നു.കാനോനിക്കൽ ഇന്റർഫെറോൺ-ഇൻഡ്യൂസിബിൾ പ്രോട്ടീനുകൾ പോസിറ്റീവ് ആന്തരിക നിയന്ത്രണമായി തിരിച്ചറിഞ്ഞു, അതേസമയം കാനോനിക്കൽ ഇന്റർഫെറോൺ-ഇൻഡ്യൂസിബിൾ പ്രോട്ടീനുകളായ MX1, UP18, OAS3, STAT1 എന്നിവയുടെ പുതിയ ഇന്റർമോളിക്യുലർ, ഇൻട്രാമോളിക്യുലാർ ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് അഡക്‌റ്റുകൾ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു.വിവിധ ഘടനാപരമായ സവിശേഷതകളും പ്രവർത്തന മേഖലകളിലെ ഇടപെടലുകളും അന്വേഷിച്ചു.
HLA-A, MDN1, H2B എന്നിവ തമ്മിലുള്ള പ്രതിപ്രവർത്തനം IFNα ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ചതും ചികിത്സിക്കാത്തതുമായ Flo-1, A549 സെല്ലുകളിൽ ഇമ്മ്യൂണോബ്ലോട്ടിംഗ് വഴി കണ്ടെത്തി.IFNα-ആശ്രിത രീതിയിൽ H2B ഉള്ള HLA-A കോംപ്ലക്സുകൾ ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ എടുത്തുകാണിക്കുന്നു.ഈ രണ്ട് സമുച്ചയങ്ങളുടെയും സഹ-പ്രാദേശികവൽക്കരണത്തിന്റെ കൂടുതൽ പര്യവേക്ഷണത്തിനുള്ള രസകരമായ ഒരു വഴിയാണ് ഞങ്ങളുടെ ജോലി പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നത്.സെൽ-ടൈപ്പ്-സ്വതന്ത്ര ഇന്റർഫെറോൺ-മധ്യസ്ഥ പ്രോട്ടീൻ ഇടപെടലുകൾ തിരിച്ചറിയാൻ സെൽ ലൈനുകളുടെ പാനലിലേക്ക് CLMS സമീപനം വിപുലീകരിക്കുന്നതും രസകരമായിരിക്കും.അവസാനമായി, ഇൻട്രാമോളിക്യുലാർ, ഇന്റർമോളിക്യുലാർ ക്രോസ്-ടോക്കുകൾ ട്രാക്ക് ചെയ്യുന്ന H2BFS-HLA-A-HMGA1 കോംപ്ലക്സിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന പ്രോട്ടീനുകളുടെ അനുരൂപമായ ചലനാത്മകത മനസ്സിലാക്കുന്നതിനുള്ള ഒരു ബദൽ സമീപനമായി ഞങ്ങൾ MD മോഡലിംഗ് ഉപയോഗിച്ചു.CLMS ഡാറ്റയിൽ നിന്നുള്ള അനുമാനങ്ങൾ H2BFS, HLA-A, HMGA1 എന്നീ പ്രോട്ടീനുകളുടെ വ്യത്യസ്‌ത അനുരൂപീകരണങ്ങളുടെ സാധ്യതയെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.ഈ ഡോക്കിംഗ് പ്രോട്ടീൻ കോംപ്ലക്സുകൾ തമ്മിലുള്ള സാധ്യമായ വ്യത്യസ്ത അനുരൂപങ്ങൾ CLMS ഡാറ്റാസെറ്റിൽ നിരീക്ഷിച്ചതിന് സമാനമായ നിരവധി ഇടപെടലുകൾ വെളിപ്പെടുത്തി.എച്ച്‌എൽഎ പോലുള്ള ഉയർന്ന പോളിമോർഫിക് ജീനുകളെ എളുപ്പത്തിൽ തിരിച്ചറിയാൻ ഇത് അനുവദിക്കുന്നു എന്നതാണ് ഞങ്ങളുടെ രീതിയുടെ പ്രധാന ശക്തികളിലൊന്ന്, അതിനാൽ പഠിക്കാൻ ബുദ്ധിമുട്ടുള്ള എച്ച്എൽഎ ഹാപ്ലോടൈപ്പ്-നിർദ്ദിഷ്ട പ്രോട്ടീനുകളുടെ ഇടപെടലുകൾ പഠിക്കുന്നത് രസകരമായിരിക്കും.ഒരുമിച്ച് എടുത്താൽ, ഇന്റർഫെറോൺ-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് സിഗ്നലിംഗ് നെറ്റ്‌വർക്കുകളെക്കുറിച്ചുള്ള ഞങ്ങളുടെ ധാരണ വിപുലീകരിക്കാനും ട്യൂമർ മൈക്രോ എൻവയോൺമെന്റിലെ കൂടുതൽ സങ്കീർണ്ണമായ ഇന്റർസെല്ലുലാർ സിസ്റ്റങ്ങൾ പഠിക്കുന്നതിനുള്ള അടിസ്ഥാനം നൽകാനും CLMS ഉപയോഗിക്കാമെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ തെളിയിക്കുന്നു.
Flo-1 സെല്ലുകൾ ATCC-യിൽ നിന്ന് ലഭിക്കുകയും 1% പെൻസിലിൻ/സ്ട്രെപ്റ്റോമൈസിൻ (ഇൻവിട്രോജൻ), 10% ഫീറ്റൽ ബോവിൻ സെറം (Gibco) എന്നിവയോടൊപ്പം DMEM (Gibco)-ൽ പരിപാലിക്കുകയും 37°C, 5% CO2 എന്നിവയിൽ സൂക്ഷിക്കുകയും ചെയ്തു.ഇൻകുബേഷൻ.IFNα14 (എഡിൻബർഗ് പ്രോട്ടീൻ പ്രൊഡക്ഷൻ ഫെസിലിറ്റി നിർമ്മിച്ചത്) ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിക്കുന്നതിന് മുമ്പ് കോശങ്ങൾ 70-80% സംഗമസ്ഥാനത്തേക്ക് വളർന്നു.മറ്റുവിധത്തിൽ സൂചിപ്പിച്ചിട്ടില്ലെങ്കിൽ മറ്റെല്ലാ രാസവസ്തുക്കളും റിയാക്ടറുകളും സിഗ്മ ആൽഡ്രിച്ചിൽ നിന്ന് വാങ്ങിയതാണ്.
ഫ്ലോ-1 സെല്ലുകൾ 6-കിണർ പ്ലേറ്റുകളിൽ സംസ്ക്കരിച്ചു, അടുത്ത ദിവസം സെല്ലുകൾ 10 ng/ml IFNα14 ഉപയോഗിച്ച് 24 മണിക്കൂർ മുതൽ ഏകദേശം 80% സംഗമം വരെ ചികിത്സിച്ചു.സെല്ലുകൾ പിബിഎസ് ഉപയോഗിച്ച് മൂന്ന് തവണ കഴുകി, പുതുതായി തയ്യാറാക്കിയ ഡിഎസ്എസ് (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്) (ഡിഎംഎസ്ഒയിൽ ലയിപ്പിച്ചത്) ഉപയോഗിച്ച് പിബിഎസിൽ 5 മിനിറ്റ് നേരം 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 0.5 എംഎം അവസാന സാന്ദ്രതയിലേക്ക് ബന്ധിപ്പിക്കുന്നു.DSS ക്രോസ്‌ലിങ്കിംഗ് പ്രതികരണത്തിന് പകരം PBS നൽകുകയും 37°C താപനിലയിൽ 15 മിനിറ്റ് PBS-ൽ 20 mM Tris (pH 8.0) ചേർത്ത് ശേഷിക്കുന്ന DSS ശമിപ്പിക്കുകയും ചെയ്തു.കോശങ്ങൾ സ്‌ക്രാപ്പ് ചെയ്‌ത് ശേഖരിക്കുകയും ലോ ബൈൻഡിംഗ് ട്യൂബുകളിൽ (ആക്‌സിജൻ) ശേഖരിക്കുകയും ചെയ്തു.
300 μl യൂറിയ ലിസിസ് ബഫർ (8 എം യൂറിയ, 0.1 എം ട്രൈസ്, പിഎച്ച് 8.5) ഉപയോഗിച്ച് സെൽ പെല്ലറ്റ് ഇടയ്ക്കിടെ കുലുക്കിക്കൊണ്ട് 30 മിനിറ്റ് ഊഷ്മാവിൽ ലൈസ് ചെയ്തു.എല്ലാ സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ ഘട്ടങ്ങളും 14,000 xg 8 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ നടത്തി.ലൈസേറ്റ് 10 മിനിറ്റ് സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്ത് ഒരു പുതിയ ട്യൂബിലേക്ക് സൂപ്പർനാറ്റന്റ് മാറ്റുക.ബാക്കിയുള്ള വ്യക്തമായ കണികകൾ 150 μl രണ്ടാമത്തെ ലിസിസ് ബഫറിൽ (2 M യൂറിയ, 2% (w/v) SDS (സോഡിയം ഡോഡെസിൽ സൾഫേറ്റ്)) 30 മിനിറ്റോ അതിൽ കൂടുതലോ ഒരു ഏകീകൃത ജലീയ ലായനി ലഭിക്കുന്നതുവരെ ലയിച്ചു.ലൈസേറ്റ് 20 മിനിറ്റ് സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്യുകയും മുൻ ഘട്ടത്തിൽ ലഭിച്ച ലൈസേറ്റുമായി സൂപ്പർനാറ്റന്റ് കലർത്തുകയും ചെയ്തു.മൈക്രോപ്ലേറ്റ് നടപടിക്രമങ്ങൾക്കായുള്ള നിർമ്മാതാവിന്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾ അനുസരിച്ച് മൈക്രോ ബിസിഎ അസ്സെ (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്) ഉപയോഗിച്ച് പ്രോട്ടീൻ സാന്ദ്രത വിലയിരുത്തി.സാമ്പിളുകൾ വേഗത്തിൽ ദ്രാവക നൈട്രജനിൽ ഫ്രീസുചെയ്‌ത് -80 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ സംഭരിച്ചു.
വിഷ്‌നെവ്‌സ്‌കി തുടങ്ങിയവർ വിവരിച്ചതുപോലെ, ഏകദേശം 100 μg ലയിക്കുന്ന ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് പ്രോട്ടീൻ പരിഷ്‌ക്കരിച്ച ഫിൽട്രേഷൻ സാമ്പിൾ തയ്യാറെടുപ്പ് പ്രോട്ടോക്കോൾ (FASP) ഉപയോഗിച്ച് പ്രോസസ്സ് ചെയ്തു.69 ചുരുക്കത്തിൽ, പ്രോട്ടീൻ 200 µl യൂറിയ ബഫറുമായി ക്രോസ്ലിങ്ക് ചെയ്തിരിക്കുന്നു (0.1 M ട്രിസിൽ 8 M യൂറിയ, pH 8.5), ചുഴലിക്കാറ്റും പകുതിയും.എല്ലാ സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ ഘട്ടങ്ങളും 25 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 14,000 xg-ൽ നടത്തി.ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് പ്രോട്ടീൻ ലൈസേറ്റിന്റെ ആദ്യ പകുതി അൾട്രാസെൽ-10 മെംബ്രൺ (മെർക്ക്) ഘടിപ്പിച്ച 10 kDa മൈക്രോകോൺ സെൻട്രിഫ്യൂഗൽ ഫിൽട്ടർ ഉപകരണത്തിലേക്ക് മാറ്റി, തുടർന്ന് ഫിൽട്ടറിൽ 25 മിനിറ്റ് സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ നടത്തി.അതിനുശേഷം പ്രോട്ടീന്റെ രണ്ടാം പകുതി ഫിൽട്ടറിലേക്ക് ചേർക്കുകയും അതേ ഘട്ടങ്ങൾ ആവർത്തിക്കുകയും ചെയ്യുക.യൂറിയ ബഫറിൽ 100 ​​μl 17 എംഎം ട്രൈസ്(2-കാർബോക്സിതൈൽ)ഫോസ്ഫൈൻ ഹൈഡ്രോക്ലോറൈഡ് (ടിസിഇപി) ചേർത്താണ് പ്രോട്ടീൻ വീണ്ടെടുക്കൽ നടത്തിയത്.37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 30 മിനിറ്റ് നേരം 600 ആർപിഎമ്മിൽ തെർമോമിക്സറിൽ വീണ്ടെടുക്കൽ ഇളക്കി.കൂടാതെ, കോളം സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്യുകയും യൂറിയ ബഫറിൽ 100 ​​μl 50 mM iodoacetamide ഉപയോഗിച്ച് ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് പ്രോട്ടീൻ ആൽക്കൈലേറ്റ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.ഇരുട്ടിൽ 20 മിനിറ്റ് ഊഷ്മാവിൽ ആൽക്കൈലേഷൻ പ്രതികരണം നടത്തി.കോളം തിരിക്കുക, 100 µl യൂറിയ ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് നിരയുടെ ചുവരുകൾ 3 തവണ കഴുകുക, തുടർന്ന് സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്യുക.100 എംഎം അമോണിയം ബൈകാർബണേറ്റിന്റെ 100 μl ഉപയോഗിച്ച് ഒരേ പ്രവർത്തനം 3 തവണ നടത്തി.ട്രൈപ്സിനൈസേഷന് മുമ്പ്, ശേഖരണ ട്യൂബ് പുതിയൊരെണ്ണം ഉപയോഗിച്ച് മാറ്റിസ്ഥാപിക്കുക.50 എംഎം അമോണിയം ബൈകാർബണേറ്റും ട്രൈപ്സിൻ ബഫറിൽ (പ്രോമേഗ) ലയിപ്പിച്ച 1 µl ട്രൈപ്സിനും അടങ്ങിയ ദഹന ബഫർ ചേർക്കുക.പ്രോട്ടീനും ട്രൈപ്‌സിനും തമ്മിലുള്ള അനുപാതം ഏകദേശം 1:33 ആയി നിലനിർത്തി, ഈർപ്പമുള്ള ഒരു അറയിൽ 37° C. താപനിലയിൽ ദഹനപ്രക്രിയകൾ രാത്രി മുഴുവൻ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്‌തു.ക്രോസ്‌ലിങ്ക് ചെയ്‌ത പെപ്‌റ്റൈഡ് 25 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ വഴി ഫിൽട്ടറിൽ നിന്ന് നീക്കം ചെയ്‌തു.ഫിൽട്ടറിലേക്ക് 50 μl 0.5 M NaCl ചേർത്തുകൊണ്ട് പെപ്റ്റൈഡ് വീണ്ടെടുക്കൽ മെച്ചപ്പെടുത്തി, തുടർന്ന് 25 മിനിറ്റ് സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ നടത്തി.
C18 മൈക്രോ സ്പിൻ നിരകൾ (ഹാർവാർഡ് അപ്പാരറ്റസ്) ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് ട്രിപ്റ്റിക് പെപ്റ്റൈഡുകൾ ഡീസാൾട്ട് ചെയ്യാൻ ഉപയോഗിച്ചത് ചെറിയ പരിഷ്കാരങ്ങളോടെ ബൗച്ചലും മറ്റുള്ളവരും വിവരിച്ച പ്രോട്ടോക്കോൾ അനുസരിച്ച്.ചുരുക്കത്തിൽ, അസെറ്റോണിട്രൈലിൽ (എസിഎൻ) (മെർക്ക്) 0.1% ഫോർമിക് ആസിഡ് (എഫ്എ) മൂന്ന് വാഷുകളും 0.1% എഫ്എയുടെ രണ്ട് വാഷുകളും ഉപയോഗിച്ച് C18 സ്പിൻ നിരകൾ സജീവമാക്കി.കോളം 15 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 0.1% FA ഉപയോഗിച്ച് ജലാംശം നൽകി.സാമ്പിളുകൾ സ്പിൻ കോളങ്ങളിലേക്ക് ലോഡുചെയ്ത് 0.1% എഫ്എ ഉപയോഗിച്ച് 3 തവണ കഴുകുക.0.1% എഫ്എയിൽ 50%, 80%, 100% AcN എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് ഒരു സ്റ്റെപ്‌വൈസ് ഗ്രേഡിയന്റ് ഉപയോഗിച്ച് ഡിസാൾട്ടഡ് പെപ്റ്റൈഡുകൾ തുടർച്ചയായി ഒഴിവാക്കി.ശേഷിക്കുന്ന ദ്രാവകം പൂർണ്ണമായും അപ്രത്യക്ഷമാകുന്നതുവരെ സാമ്പിളുകൾ സ്പീഡ്വാക് പ്ലസ് കോൺസെൻട്രേറ്ററിൽ (എപ്പൻഡോർഫ്) ഉണക്കി.എല്യൂട്ടഡ് പെപ്റ്റൈഡുകൾ 100 μl 0.08% ട്രൈഫ്ലൂറോഅസെറ്റിക് ആസിഡിൽ 2.5% AcN-ൽ ലയിപ്പിച്ച് നാനോഡ്രോപ്പ് 2000 (തെർമോ സയന്റിഫിക്) ഉപയോഗിച്ച് സാന്ദ്രത അളക്കുന്നു.ഓരോ സാമ്പിളിലും ഏകദേശം 1 μg ക്രോസ്ലിങ്ക്ഡ് പെപ്റ്റൈഡ് LC-MS/MS സിസ്റ്റത്തിലേക്ക് കുത്തിവച്ചിരിക്കുന്നു.
ഒരു ഓർബിട്രാപ്പ് എക്സ്പ്ലോറിസ് 480 മാസ്സ് സ്പെക്ട്രോമീറ്ററുമായി (തെർമോ സയന്റിഫിക്) ബന്ധിപ്പിച്ചിട്ടുള്ള അൾട്ടിമേറ്റ് 3000 ആർഎസ്എൽസി നാനോ എൽസി സിസ്റ്റത്തിൽ (തെർമോ സയന്റിഫിക്) ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് പെപ്റ്റൈഡുകൾ വേർതിരിച്ചു.C18 PepMap100 sorbent, 5 µm PepMap sorbent (Thermo Scientific) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് പായ്ക്ക് ചെയ്ത 300 µm ID, 5 mm നീളമുള്ള µ-പ്രീ കോളം C18 ക്യാപ്‌ചർ കോളത്തിൽ ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് പെപ്റ്റൈഡുകൾ ശേഖരിച്ചു.2.5% AcN-ൽ ലയിപ്പിച്ച 0.08% ട്രൈഫ്ലൂറോഅസെറ്റിക് ആസിഡ് 5 µl/min-ൽ പമ്പ് ഫ്ലോ സെറ്റ് ലോഡ് ചെയ്യുക.2 μm PepMap sorbent (Thermo Scientific) നിറച്ച 75 μm ആന്തരിക വ്യാസവും 150 mm നീളവുമുള്ള ഒരു അനലിറ്റിക്കൽ ഫ്യൂസ്ഡ് സിലിക്ക കോളത്തിൽ ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് പെപ്റ്റൈഡുകൾ വേർതിരിച്ചിരിക്കുന്നു.മൊബൈൽ ഘട്ടങ്ങൾ എ, ബി എന്നിവയിൽ യഥാക്രമം വെള്ളത്തിൽ 0.1% എഫ്എയും അസെറ്റോണിട്രൈലിൽ 0.1% എഫ്എയും അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു.ഗ്രേഡിയന്റ് 2.5% B-ൽ ആരംഭിക്കുകയും 90 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ 40% B ലേക്ക് രേഖീയമായി വർദ്ധിക്കുകയും അടുത്ത 2 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ 90% B ലേക്ക് വർദ്ധിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.മൊബൈൽ ഫേസ് കോമ്പോസിഷൻ 10 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 90% ബിയിൽ നിലനിർത്തി, തുടർന്ന് 2 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ രേഖീയമായി 2.5% ബി ആയി കുറഞ്ഞു.അടുത്ത സൈക്കിളിന് മുമ്പ് 8 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് കോളം 2.5% B യിൽ സമതുലിതമാക്കി.അനലിറ്റിക്കൽ കോളത്തിൽ നിന്ന് പുറത്തെടുത്ത ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് പെപ്റ്റൈഡുകൾ ഒരു നാനോ ഇലക്ട്രോസ്പ്രേ അയോണൈസേഷൻ (എൻഎസ്ഐ) ഉറവിടത്തിൽ അയോണൈസ് ചെയ്യുകയും ഒരു എക്സ്പ്ലോറിസ് 480 മാസ് സ്പെക്ട്രോമീറ്ററിലേക്ക് (തെർമോ സയന്റിഫിക്) കുത്തിവയ്ക്കുകയും ചെയ്തു.
ഓർബിട്രാപ്പ് എക്സ്പ്ലോറിസ് 480 മാസ് സ്പെക്ട്രോമീറ്റർ പോസിറ്റീവ് ഡാറ്റ കോറിലേഷൻ മോഡിൽ പ്രവർത്തിക്കുന്നു.m/z 350 Th മുതൽ m/z 2000 Th വരെയുള്ള ശ്രേണി ക്രമീകരണങ്ങളോടെ 120,000 റെസല്യൂഷനിൽ സെക്ഷൻ മോഡിൽ ഒരു പൂർണ്ണ സ്കാൻ നടത്തി.സാധാരണവൽക്കരിച്ച AGC ടാർഗെറ്റ് 300% ആയി സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്നു, പരമാവധി ഇൻപുട്ട് സമയം 50ms.പെപ്റ്റൈഡുകൾക്കായി മോണോ ഐസോടോപ്പിക് പീക്ക് ഡിറ്റക്ഷൻ സ്ഥാപിച്ചിട്ടുണ്ട്.വളരെ കുറച്ച് മുൻഗാമികൾ കണ്ടെത്തിയാൽ കൺസ്ട്രെയിന്റ് റിലാക്സേഷൻ പാരാമീറ്റർ ശരിയായി സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്നു.മുൻഗാമിയുടെ ഏറ്റവും കുറഞ്ഞ അയോണിക് ശക്തി 5.0e3 ആയി സജ്ജീകരിച്ചു കൂടാതെ +8 വരെയുള്ള മുൻഗാമി ചാർജ് അവസ്ഥകൾ പരീക്ഷണങ്ങളിൽ ഉൾപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട്.
ഡാറ്റാ കോറിലേഷൻ മോഡിൽ പ്രധാന സ്കാനുകൾക്കിടയിലുള്ള സൈക്കിൾ സമയം 2.5 സെക്കൻഡായി സജ്ജീകരിച്ചു.മുൻഗാമി അയോണിന്റെ ആദ്യ വിഘടനത്തിന് ശേഷം ഡൈനാമിക് മാസ് ഒഴിവാക്കൽ 20 സെക്കൻഡായി സജ്ജമാക്കി.മുൻഗാമി ഐസൊലേഷൻ വിൻഡോ 2 th ആയി സജ്ജീകരിച്ചു.ഒരു നിശ്ചിത കൊളിഷൻ എനർജി മോഡ് ഉള്ള നോർമലൈസ്ഡ് കൊളിഷൻ എനർജി തരം ഒരു ഡാറ്റാ ആശ്രിത MS/MS സ്കാനിൽ തിരഞ്ഞെടുത്തു.കൂട്ടിയിടി ഊർജ്ജം 30% ആയി സജ്ജമാക്കി.Orbitrap റെസല്യൂഷൻ 15,000 ആയും AGC ടാർഗെറ്റ് 100% ആയും സജ്ജീകരിച്ചു.ഇഷ്‌ടാനുസൃത പരമാവധി ഇഞ്ചക്ഷൻ സമയം 60 മില്ലിസെക്കൻഡായി സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്നു.
ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് സാമ്പിളുകളിൽ പ്രോട്ടീൻ-പ്രോട്ടീൻ നെറ്റ്‌വർക്ക് ട്രാക്കുചെയ്യുന്നതിന് മുമ്പ്, സാമ്പിളുകളിൽ കണ്ടെത്താനാകുന്ന പെപ്റ്റൈഡുകൾ/പ്രോട്ടീനുകൾ തിരിച്ചറിയാൻ MaxQuant പാക്കേജ് (പതിപ്പ് 1.6.12.0)26,27 ഉപയോഗിച്ച് ഞങ്ങൾ റോ ഫയലുകൾ പ്രോസസ്സ് ചെയ്തു.കൂടാതെ, IFNα ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ചതും ചികിത്സിക്കാത്തതുമായ ക്രോസ്ലിങ്ക് ചെയ്യാത്ത Flo-1 സാമ്പിളുകളിൽ സമാനമായ പ്രോട്ടിയോമിക് വിശകലനങ്ങൾ നടത്തി.അന്തർനിർമ്മിത തിരയൽ എഞ്ചിൻ Andromeda27 ഉപയോഗിച്ച് UniProt ഹ്യൂമൻ ഡാറ്റാബേസിൽ (www.uniprot.org) MS/MS ഡാറ്റ തിരഞ്ഞു (2020 ഓഗസ്റ്റ് 12-ന് അപ്‌ലോഡ് ചെയ്തത്, 75,093 എൻട്രികൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു).എൻസൈമിന്റെ പ്രത്യേകതയും ഡീമൈഡേഷൻ (N, Q), ഓക്സിഡേഷൻ (M) എന്നിവയുടെ വിവിധ പരിഷ്കാരങ്ങളും സൂചിപ്പിക്കാതെയാണ് തിരച്ചിൽ നടത്തിയത്.മുൻഗാമി മാസ് ടോളറൻസുകൾ 20 ppm-ലും ഉൽപ്പന്ന അയോണുകൾ 0.02 Da-ലും സജ്ജമാക്കി.പ്രാരംഭവും കൂടിയതുമായ മാസ് ഡീവിയേഷൻ 10 ppm ആയി സജ്ജീകരിച്ചു.പെപ്റ്റൈഡിന്റെ പരമാവധി പിണ്ഡം 4600 Da ആയി സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്നു, കൂടാതെ 7 മുതൽ 25 അമിനോ ആസിഡുകൾ (aa) നും ഇടയിൽ ക്രമ സാമ്യം സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്നു.കൂടുതൽ സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ വിശകലനം Perseus പ്രോഗ്രാം (പതിപ്പ് 1.6.10.45) ഉപയോഗിച്ച് നടത്തി.പ്രോട്ടീന്റെ സ്പെക്ട്രൽ തീവ്രത നോർമലൈസ് ചെയ്തുകൊണ്ടാണ് പ്രോട്ടീൻ ഉള്ളടക്കം കണക്കാക്കുന്നത് (LFQ തീവ്രത; ലേബൽ ചെയ്യാത്ത അളവ്) 27 തീവ്രത മൂല്യങ്ങൾ Log2 ആയി പരിവർത്തനം ചെയ്തു.പ്രോട്ടീനുകളുടെ പെപ്‌റ്റൈഡ് തീവ്രതയാൽ തിരിച്ചറിയപ്പെടുന്ന ഒരു ഹൈറാർക്കിക്കൽ ക്ലസ്റ്ററിംഗ് നിർമ്മിച്ചിരിക്കുന്നത് R (v 4.1.2) ലെ pheatmap (v1.0.12) പാക്കേജ് ഉപയോഗിച്ചാണ്.IFNα- ചികിത്സിച്ച പ്രോട്ടീനുകൾക്കായുള്ള റിയാക്ടോം പാത്ത്‌വേ ഡാറ്റാബേസ് ഉപയോഗിച്ച് പാത്ത്‌വേ സമ്പുഷ്ടീകരണ വിശകലനം നടത്തി, അവ ചികിത്സിക്കാത്ത സാമ്പിളുകളെ അപേക്ഷിച്ച് നാലിരട്ടിയിലധികം സജീവമാണ്.
എൽസി-എംഎസ്/എംഎസ് നിരീക്ഷിക്കുന്ന പ്രോട്ടീൻ കോംപ്ലക്സുകളുടെ ലൈസിൻ (കെ) അല്ലെങ്കിൽ സെറിൻ (എസ്) നിർദ്ദിഷ്ട കെമിക്കൽ ക്രോസ്ലിങ്കുകൾ തിരിച്ചറിയുന്നത് ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് പെപ്റ്റൈഡുകൾക്ക് (സിം-എക്സ്എൽ) സ്പെക്ട്രോസ്കോപ്പിക് ഐഡന്റിഫിക്കേഷൻ മെഷീൻ (സിം-എക്സ്എൽ) ഉപയോഗിച്ചാണ്.ആദ്യം, ഇന്റർഫെറോൺ-അസോസിയേറ്റഡ് (ഐഎഫ്എൻ) ഡിഎൻഎ കേടുപാടുകൾ പ്രതിരോധം സിഗ്നേച്ചർ (ഐആർഡിഎസ്) ജീനുകൾ തമ്മിലുള്ള സാധ്യമായ ഇടപെടലുകൾ പദാരിയയിലും മറ്റും വിവരിച്ചിട്ടുള്ള ഐആർഡിഎസ് പ്രോട്ടീൻ ഡാറ്റാസെറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് അന്വേഷിച്ചു.മുഴുവൻ ഹ്യൂമൻ യുണിപ്രോട്ടിന്റെയും എല്ലാ വ്യവസ്ഥകളും ആവർത്തനങ്ങളും സ്‌ക്രീൻ ചെയ്യുന്നത് കമ്പ്യൂട്ടേഷണൽ തീവ്രമാണ്, അതിനാൽ IFNα- ചികിത്സിച്ച ആവർത്തനങ്ങൾക്കെതിരെ മുഴുവൻ ഹ്യൂമൻ യുണിപ്രോട്ട് ഡാറ്റാബേസും (www.uniprot.org) (12 ഓഗസ്റ്റ് 2020 ഡൗൺലോഡ് ചെയ്‌തു, 75,093 എൻട്രികൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു).ഉയർന്ന വിശ്വാസ്യതയുള്ള ഇടപെടലുകൾക്കുള്ള ഫിൽട്ടറുകളിലൊന്ന്.ലഭിച്ച ഈ ഉയർന്ന പ്രാധാന്യമുള്ള ഇടപെടലുകൾ എല്ലാ ആവർത്തനങ്ങളിലും വ്യവസ്ഥകളിലും വിപുലീകരിക്കുകയും പരീക്ഷിക്കുകയും ചെയ്തു.
SIM-XL-ൽ, ക്രോസ്ലിങ്കറിനായി (XL) DSS ഉപയോഗിച്ചു, കൂടാതെ XL വെയ്റ്റ് ഷിഫ്റ്റും മോഡിഫിക്കേഷൻ വെയ്റ്റ് ഷിഫ്റ്റും യഥാക്രമം 138.06, 156.07 എന്നിങ്ങനെ സജ്ജീകരിച്ചു.ഇനിപ്പറയുന്ന ക്രോസ്‌ലിങ്കിംഗ് പ്രതികരണ സൈറ്റുകൾ പരിഗണിക്കപ്പെടുന്നു: റിപ്പോർട്ടർ അയോണുകൾ ഇല്ലാതെ KK, KS, KN-TERM.മുൻഗാമിയും ഫ്രാഗ്മെന്റ് പിപിഎമ്മും 20 ആയും Xrea ത്രെഷോൾഡ് 0.15 ആയും സജ്ജീകരിച്ചു.ട്രിപ്സിൻ പൂർണ്ണമായും നിർദ്ദിഷ്ടമാണെന്ന് കണക്കാക്കുകയും ഉയർന്ന ഊർജ്ജ സി-ട്രാപ്പ് (എച്ച്സിഡി) വിഘടന രീതി നടപ്പിലാക്കുകയും ചെയ്തു.XCorr ഡൈനാമിക് ഡിബി റിഡക്ഷൻ ത്രെഷോൾഡും ഡൈനാമിക് ഡിബി റിഡക്ഷനുള്ള പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ ഏറ്റവും കുറഞ്ഞ എണ്ണവും യഥാക്രമം 2.5, 2 എന്നിങ്ങനെ സജ്ജീകരിച്ചു.മറ്റ് പാരാമീറ്ററുകൾ ഇവയാണ്: മോണോ ഐസോടോപ്പ് പ്രോബബിലിറ്റിയും പീക്ക് യാദൃശ്ചികത കട്ട്‌ഓഫ്, ഓരോ സ്‌ട്രാൻഡിനും കുറഞ്ഞത് 4 AA അവശിഷ്ടങ്ങളും പരമാവധി സ്‌ട്രാൻഡ് ചാർജും, കൂടാതെ 3 മാക്‌സിമ മിസ്‌ഡ് സ്‌പ്ലിറ്റുകളും.തത്ഫലമായി തുന്നിച്ചേർത്ത 2D മാപ്പുകൾ (SIM-XL) ൽ വിശകലനം ചെയ്യുകയും 2D മാപ്പുകൾ നിർമ്മിക്കാൻ xQuest28 ഗ്രാഫിക്കൽ പ്രാതിനിധ്യം ഉപയോഗിക്കുകയും ചെയ്തു.പ്രോട്ടീൻ ഘടനകളിലെ പ്രോട്ടീൻ ക്രോസ്ലിങ്കുകൾ PyMol-ൽ നൽകിയിരിക്കുന്നു (PyMOL മോളിക്യുലർ ഗ്രാഫിക്സ് സിസ്റ്റം, പതിപ്പ് 2.0 ഷ്രോഡിംഗർ, LLC).
"ഹിഡൻ മാർക്കോവ് രീതി" യുടെ ഹോമോളജി മോഡലിംഗിന്റെയും നടപ്പിലാക്കലിന്റെയും തത്വങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച് Phyre2 സെർവർ (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 ഉപയോഗിച്ച് പ്രോട്ടീൻ മോഡൽ ഘടനകൾ സൃഷ്ടിച്ചു.അറിയപ്പെടുന്ന പ്രോട്ടീൻ ഘടനകളുമായുള്ള അനുക്രമ വിന്യാസത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കി Phyre2 മോഡൽ ഘടനകൾ സൃഷ്ടിക്കുന്നു.H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4, MDN1 പ്രോട്ടീനുകൾക്കായി, ടെംപ്ലേറ്റ് ഘടനകൾ 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62, 6i2665 എന്നിവ ഉപയോഗിച്ചു.കൂടാതെ, AlphaFold71 MX1, UBP18, ROBO1 എന്നിവയുടെ ഘടനയും പരിഗണിച്ചു.BIOVIA ഡിസ്കവറി സ്റ്റുഡിയോ വിഷ്വലൈസർ പാക്കേജും (Dassault Systemes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) മോളിക്യുലർ ഓപ്പറേറ്റിംഗ് എൻവയോൺമെന്റ് പാക്കേജും (MOE; കെമിക്കൽ കമ്പ്യൂട്ടിംഗ് ഗ്രൂപ്പ് Inc., Montreal, Quebec, Canada) ഉപയോഗിച്ചാണ് പ്രോട്ടീൻ ഘടന ദൃശ്യവൽക്കരിച്ചത്.