347 12.7*1.24mm സ്റ്റെയിൻലെസ്സ് സ്റ്റീൽ കോയിൽഡ് ട്യൂബിംഗ്, സിൻക്രണസ് ഇലക്ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് കണ്ടൻസേഷന്റെ തന്മാത്രാ സംവിധാനം, α-synuclein, tau എന്നിവയുടെ കോഗ്ഗ്രഗേഷൻ

Nature.com സന്ദർശിച്ചതിന് നന്ദി.പരിമിതമായ CSS പിന്തുണയുള്ള ഒരു ബ്രൗസർ പതിപ്പാണ് നിങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്നത്.മികച്ച അനുഭവത്തിനായി, നിങ്ങൾ ഒരു അപ്‌ഡേറ്റ് ചെയ്‌ത ബ്രൗസർ ഉപയോഗിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു (അല്ലെങ്കിൽ Internet Explorer-ൽ അനുയോജ്യത മോഡ് പ്രവർത്തനരഹിതമാക്കുക).കൂടാതെ, നിലവിലുള്ള പിന്തുണ ഉറപ്പാക്കാൻ, ഞങ്ങൾ ശൈലികളും JavaScript ഇല്ലാതെ സൈറ്റ് കാണിക്കുന്നു.
ഓരോ സ്ലൈഡിലും മൂന്ന് ലേഖനങ്ങൾ കാണിക്കുന്ന സ്ലൈഡറുകൾ.സ്ലൈഡുകളിലൂടെ നീങ്ങാൻ ബാക്ക്, അടുത്ത ബട്ടണുകൾ ഉപയോഗിക്കുക അല്ലെങ്കിൽ ഓരോ സ്ലൈഡിലൂടെയും നീങ്ങാൻ അവസാനത്തെ സ്ലൈഡ് കൺട്രോളർ ബട്ടണുകൾ ഉപയോഗിക്കുക.

347 സ്റ്റെയിൻലെസ്സ് സ്റ്റീൽ പൈപ്പ് സ്പെസിഫിക്കേഷൻ

347 12.7*1.24എംഎം സ്റ്റെയിൻലെസ്സ് സ്റ്റീൽ കോയിൽഡ് ട്യൂബിംഗ്

പുറം വ്യാസം: 6.00 mm OD മുതൽ 914.4 mm OD വരെ, 24” NB വരെ വലുപ്പങ്ങൾ ലഭ്യമാണ് എക്സ്-സ്റ്റോക്ക്, OD വലുപ്പമുള്ള സ്റ്റീൽ ട്യൂബുകൾ ലഭ്യമാണ് എക്സ്-സ്റ്റോക്ക്

SS 347 പൈപ്പ് കനം പരിധി: 0.3mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, മുതലായവ (0.5-12mm) അല്ലെങ്കിൽ നോൺ-റെഗുലർ വലുപ്പം ആവശ്യാനുസരണം ക്രമീകരിക്കണം

തരം: SS 347 തടസ്സമില്ലാത്ത പൈപ്പുകൾ |SS 347 ERW പൈപ്പുകൾ |SS 347 വെൽഡഡ് പൈപ്പുകൾ |SS 347 ഫാബ്രിക്കേറ്റഡ് പൈപ്പുകൾ |SS 347 CDW ട്യൂബുകൾ, LSAW പൈപ്പുകൾ / സീം-വെൽഡിഡ് / വീണ്ടും വരച്ച

ഫോം: SS 347 റൗണ്ട് പൈപ്പുകൾ/ട്യൂബുകൾ, SS 347 ചതുരാകൃതിയിലുള്ള പൈപ്പുകൾ/ട്യൂബുകൾ, SS 347 ചതുരാകൃതിയിലുള്ള പൈപ്പുകൾ/ട്യൂബുകൾ, SS 347 കോയിൽഡ് ട്യൂബുകൾ, SS 347 "U" ആകൃതി, SS 347 പാൻ കേക്ക് ട്യൂബുകൾ, Hydraulic 347

നീളം: സിംഗിൾ റാൻഡം, ഡബിൾ റാൻഡം & ആവശ്യമുള്ള ദൈർഘ്യം അവസാനം: പ്ലെയിൻ എൻഡ്, ബെവെൽഡ് എൻഡ്, ചവിട്ടി

എൻഡ് പ്രൊട്ടക്ഷൻ: പ്ലാസ്റ്റിക് ക്യാപ്സ് |പുറത്ത് ഫിനിഷ്: 2B, No.4, No.1, No.8 സ്റ്റെയിൻലെസ്സ് സ്റ്റീൽ പൈപ്പുകൾക്കുള്ള മിറർ ഫിനിഷ്, ഉപഭോക്തൃ ആവശ്യകതകൾ അനുസരിച്ച് പൂർത്തിയാക്കുക

ഡെലിവറി അവസ്ഥ: അനീൽ ചെയ്തതും അച്ചാറിട്ടതും, പോളിഷ് ചെയ്തതും, ബ്രൈറ്റ് അനീൽ ചെയ്തതും, കോൾഡ് ഡ്രോൺ ചെയ്തതും

പരിശോധന, ടെസ്റ്റ് റിപ്പോർട്ടുകൾ: മിൽ ടെസ്റ്റ് സർട്ടിഫിക്കറ്റുകൾ, EN 10204 3.1, കെമിക്കൽ റിപ്പോർട്ടുകൾ, മെക്കാനിക്കൽ റിപ്പോർട്ടുകൾ, PMI ടെസ്റ്റ് റിപ്പോർട്ടുകൾ, വിഷ്വൽ ഇൻസ്പെക്ഷൻ റിപ്പോർട്ടുകൾ, മൂന്നാം കക്ഷി പരിശോധനാ റിപ്പോർട്ടുകൾ, NABL അംഗീകരിച്ച ലാബ് റിപ്പോർട്ടുകൾ, വിനാശകരമായ ടെസ്റ്റ് റിപ്പോർട്ട്, നോൺ ഡെസ്‌ട്രക്റ്റീവ് ടെസ്റ്റ് റിപ്പോർട്ട്

പാക്കിംഗ്: തടി പെട്ടികളിലോ, പ്ലാസ്റ്റിക് ബാഗുകളിലോ, സ്റ്റീൽ സ്ട്രിപ്പുകളിലോ, അല്ലെങ്കിൽ ഉപഭോക്താക്കളുടെ അഭ്യർത്ഥന പ്രകാരം

പ്രത്യേകതകൾ: മുകളിലുള്ളതല്ലാത്ത വലുപ്പങ്ങളും സവിശേഷതകളും അഭ്യർത്ഥന പ്രകാരം നിർമ്മിക്കാവുന്നതാണ്

SS 347 പൈപ്പ് വലുപ്പ പരിധി:1/2 ഇഞ്ച് NB, OD മുതൽ 24 ഇഞ്ച് വരെ

ASTM A312 347: ഉയർന്ന താപനിലയ്ക്കും പൊതുവായ നാശനഷ്ട സേവനത്തിനും ഉദ്ദേശിച്ചുള്ള തടസ്സമില്ലാത്തതും നേരായതുമായ വെൽഡിഡ് ഓസ്റ്റെനിറ്റിക് പൈപ്പ്.വെൽഡിംഗ് സമയത്ത് ഫില്ലർ മെറ്റൽ അനുവദനീയമല്ല.

ASTM A358 347: ഇലക്‌ട്രിക് ഫ്യൂഷൻ വെൽഡ് ചെയ്‌ത ഓസ്റ്റെനിറ്റിക് പൈപ്പ് നശിപ്പിക്കുന്ന കൂടാതെ/അല്ലെങ്കിൽ ഉയർന്ന താപനില സേവനത്തിനായി.സാധാരണയായി 8 ഇഞ്ച് വരെ പൈപ്പ് മാത്രമേ ഈ സ്പെസിഫിക്കേഷനിൽ നിർമ്മിക്കപ്പെടുകയുള്ളൂ.വെൽഡിങ്ങ് സമയത്ത് ഫില്ലർ മെറ്റൽ ചേർക്കുന്നത് അനുവദനീയമാണ്.

ASTM A790 347: സ്ട്രെസ് കോറഷൻ ക്രാക്കിംഗിനെതിരായ പ്രതിരോധത്തിന് പ്രത്യേക ഊന്നൽ നൽകിക്കൊണ്ട്, പൊതുവായ നശീകരണ സേവനത്തിനായി ഉദ്ദേശിച്ചിട്ടുള്ള തടസ്സമില്ലാത്തതും നേരായതുമായ വെൽഡഡ് ഫെറിറ്റിക്/ഓസ്റ്റെനിറ്റിക് (ഡ്യൂപ്ലക്സ്) പൈപ്പ്.

ASTM A409 347: സ്‌ട്രെയിറ്റ്-സീം അല്ലെങ്കിൽ സ്‌പൈറൽ-സീം ഇലക്ട്രിക് ഫ്യൂഷൻ വെൽഡ് ചെയ്‌ത വലിയ വ്യാസമുള്ള ഓസ്‌റ്റെനിറ്റിക് ലൈറ്റ്-വാൾ പൈപ്പ് 14” മുതൽ 30” വരെ വലുപ്പമുള്ള ഭിത്തികൾ Sch5S, Sch 10S എന്നിവ നാശത്തിനും/അല്ലെങ്കിൽ ഉയർന്നതും

ASTM A376 347: ഉയർന്ന താപനിലയുള്ള പ്രയോഗങ്ങൾക്കുള്ള തടസ്സമില്ലാത്ത ഓസ്റ്റെനിറ്റിക് പൈപ്പ്.

ASTM A813 347: ഉയർന്ന ഊഷ്മാവിനും പൊതുവായ വിനാശകരമായ ആപ്ലിക്കേഷനുകൾക്കുമായി സിംഗിൾ-സീം, സിംഗിൾ- അല്ലെങ്കിൽ ഡബിൾ-വെൽഡ് ഓസ്റ്റെനിറ്റിക് പൈപ്പ്.

ASTM A814 347: ഉയർന്ന ഊഷ്മാവിനും പൊതുവായ നാശനഷ്ട സേവനത്തിനുമായി കോൾഡ് വർക്ക്ഡ് വെൽഡഡ് ഓസ്റ്റെനിറ്റിക് പൈപ്പ്.

347H സ്റ്റെയിൻലെസ്സ് സ്റ്റീൽ പൈപ്പുകൾ കെമിക്കൽ കോമ്പോസിഷൻ

സ്റ്റെയിൻലെസ്സ് സ്റ്റീൽ 347H പൈപ്പ് മെക്കാനിക്കൽ പ്രോപ്പർട്ടികൾ

സ്റ്റെയിൻലെസ്സ് സ്റ്റീൽ 347H പൈപ്പുകൾ ഫിസിക്കൽ പ്രോപ്പർട്ടികൾ

347H സ്റ്റെയിൻലെസ്സ് സ്റ്റീൽ പൈപ്പിന് തുല്യമായ ഗ്രേഡുകൾ

അമിലോയ്ഡ് ആൽഫ-സിന്യൂക്ലിൻ (αS) അഗ്രഗേഷൻ പാർക്കിൻസൺസ് രോഗത്തിന്റെയും മറ്റ് സിന്യൂക്ലിനോപ്പതികളുടെയും ഒരു മുഖമുദ്രയാണ്.അടുത്തിടെ, അൽഷിമേഴ്‌സ് രോഗവുമായി സാധാരണയായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന ടൗ പ്രോട്ടീൻ αS പാത്തോളജിയുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു, കൂടാതെ αS- സമ്പുഷ്ടമായ ഉൾപ്പെടുത്തലുകളിൽ സഹ-പ്രാദേശികവൽക്കരണം കണ്ടെത്തുകയും ചെയ്തു, എന്നിരുന്നാലും രണ്ട് പ്രോട്ടീനുകളുടെ സംയോജനത്തിന്റെ തന്മാത്രാ സംവിധാനം വ്യക്തമല്ല.ടൗ പോലുള്ള പോസിറ്റീവ് ചാർജുള്ള പോളിപെപ്റ്റൈഡുകളുള്ള ഇലക്‌ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് കോംപ്ലക്‌സ് കണ്ടൻസേഷൻ വഴി αS ഘട്ടം ദ്രാവക ഘനീഭവിക്കുന്നതായി ഞങ്ങൾ ഇവിടെ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുന്നു.പോളിക്കേഷനുകളോടുള്ള αS-ന്റെ അടുപ്പവും ശീതീകരണ ശൃംഖലയുടെ വാലൻസ് ശോഷണത്തിന്റെ തോതും അനുസരിച്ച്, കട്ടകൾ ദ്രുതഗതിയിലുള്ള ജീലേഷനോ കോലസെൻസിനോ വിധേയമാകുന്നു, തുടർന്ന് സ്ലോ അമിലോയിഡ് അഗ്രഗേഷനും.നൂതന ബയോഫിസിക്കൽ ടെക്നിക്കുകളുടെ ഒരു കൂട്ടം സംയോജിപ്പിച്ച്, ദ്രാവക-ദ്രാവക αS/Tau ഘട്ടം വേർതിരിക്കൽ സ്വഭാവം കാണിക്കാനും ഒരു ദ്രാവക പ്രോട്ടീൻ കണ്ടൻസേറ്റിൽ രണ്ട് പ്രോട്ടീനുകളും അടങ്ങുന്ന വൈവിധ്യമാർന്ന അഗ്രഗേറ്റുകളുടെ രൂപീകരണത്തിലേക്ക് നയിക്കുന്ന പ്രധാന ഘടകങ്ങൾ തിരിച്ചറിയാനും ഞങ്ങൾക്ക് കഴിഞ്ഞു.
മെംബ്രൻ കമ്പാർട്ടുമെന്റുകൾക്ക് പുറമേ, ലിക്വിഡ്-ലിക്വിഡ് ഫേസ് സെപ്പറേഷൻ (എൽഎൽപിഎസ്) എന്നറിയപ്പെടുന്ന ഒരു പ്രക്രിയയിലൂടെ പ്രോട്ടീൻ സമ്പുഷ്ടമായ, ലിക്വിഡ് പോലെയുള്ള സാന്ദ്രമായ ബോഡികൾ ബയോമോളിക്യുലാർ കണ്ടൻസേറ്റുകൾ അല്ലെങ്കിൽ ഡ്രോപ്പ്ലെറ്റുകൾ രൂപപ്പെടുന്നതിലൂടെയും കോശങ്ങളിലെ സ്പേഷ്യൽ വേർതിരിവ് സാധ്യമാണ്.സാധാരണയായി പ്രോട്ടീനുകൾ അല്ലെങ്കിൽ പ്രോട്ടീനുകൾ, ആർഎൻഎ എന്നിവയ്‌ക്കിടയിലുള്ള മൾട്ടിവാലന്റ് ടെമ്പറൽ ഇന്ററാക്ഷനുകളാൽ ഈ തുള്ളികൾ രൂപം കൊള്ളുന്നു, മാത്രമല്ല മിക്കവാറും എല്ലാ ജീവജാലങ്ങളിലും വിവിധ പ്രവർത്തനങ്ങൾ ചെയ്യുന്നു.എൽഎൽപി-കഴിവുള്ള ധാരാളം പ്രോട്ടീനുകൾ പ്രകൃതിയിൽ വളരെ ക്രമരഹിതമായതും ബയോമോളിക്യുലാർ കണ്ടൻസേറ്റുകളുടെ രൂപീകരണത്തിലും കുറഞ്ഞ സങ്കീർണ്ണതയുടെ ക്രമങ്ങൾ പ്രദർശിപ്പിക്കുന്നു.ഈ ദ്രാവകരൂപത്തിലുള്ള കണ്ടൻസേറ്റുകൾ നിർമ്മിക്കുന്ന പ്രോട്ടീനുകളുടെ വഴക്കമുള്ളതും പലപ്പോഴും ക്രമരഹിതവും മൾട്ടിവാലന്റ് സ്വഭാവവും നിരവധി പരീക്ഷണാത്മക പഠനങ്ങൾ വെളിപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട്, എന്നിരുന്നാലും ഈ കണ്ടൻസേറ്റുകളുടെ വളർച്ചയും പക്വതയും കൂടുതൽ ഖരരൂപത്തിലേക്ക് നിയന്ത്രിക്കുന്ന നിർദ്ദിഷ്ട തന്മാത്രകളെ കുറിച്ച് വളരെക്കുറച്ചേ അറിയൂ. സംസ്ഥാനം..
വ്യതിചലിക്കുന്ന പ്രോട്ടീൻ പ്രവർത്തിക്കുന്ന LLPS ഉം തുള്ളികളെ ഖര ഘടനകളാക്കി മാറ്റുന്നതും പ്രസക്തമായ സെല്ലുലാർ പാതകളായിരിക്കാം, ഇത് പലപ്പോഴും ഡീജനറേറ്റീവ് രോഗങ്ങളുടെ മുഖമുദ്രയായ ലയിക്കാത്ത വിഷ അഗ്രഗേറ്റുകളുടെ രൂപീകരണത്തിലേക്ക് നയിക്കുന്നു എന്ന അനുമാനത്തെ പുതിയ ഡാറ്റ പിന്തുണയ്ക്കുന്നു.പല LLPS-അസോസിയേറ്റഡ് ഇൻട്രിൻസിക്കലി ഡിസോർഡർഡ് പ്രോട്ടീനുകളും (IDPs), പലപ്പോഴും ഉയർന്ന ചാർജുള്ളതും വഴക്കമുള്ളതും, അമിലോയിഡ് അഗ്രഗേഷൻ പ്രക്രിയയിലൂടെ ന്യൂറോഡീജനറേഷനുമായി വളരെക്കാലമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു.പ്രത്യേകിച്ചും, FUS7 അല്ലെങ്കിൽ TDP-438 പോലുള്ള ബയോമോളിക്യുലാർ IDP കണ്ടൻസേറ്റുകൾ അല്ലെങ്കിൽ hnRNPA19 പോലുള്ള വലിയ സങ്കീർണ്ണതയുള്ള ഡൊമെയ്‌നുകളുള്ള പ്രോട്ടീനുകൾ ദ്രവീകരണം എന്ന പ്രക്രിയയിലൂടെ ജെൽ പോലെയുള്ളതോ ഖരരൂപത്തിലുള്ളതോ ആയ രൂപത്തിലേക്ക് പ്രായമാകുന്നതായി കാണിക്കുന്നു.സംയുക്തം.സോളിഡ് ഫേസ് ട്രാൻസിഷനിലേക്ക് (LSPT) സമയത്തിന്റെ ഒരു ഫംഗ്‌ഷനായി അല്ലെങ്കിൽ ചില വിവർത്തനാനന്തര പരിഷ്‌ക്കരണങ്ങൾ അല്ലെങ്കിൽ പാത്തോളജിക്കൽ പ്രാധാന്യമുള്ള മ്യൂട്ടേഷനുകൾക്കുള്ള പ്രതികരണം1,7.
വിവോയിലെ എൽഎൽപിഎസുമായി ബന്ധപ്പെട്ട മറ്റൊരു ഐഡിപി ടൗ ആണ്, മൈക്രോട്യൂബുൾ-അസോസിയേറ്റഡ് ഡിസോർഡർഡ് പ്രോട്ടീൻ, ഇതിന്റെ അമിലോയിഡ് അഗ്രഗേഷൻ അൽഷിമേഴ്‌സ് രോഗത്തിൽ ഉൾപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെങ്കിലും അടുത്തിടെ പാർക്കിൻസൺസ് രോഗത്തിലും (പിഡി) മറ്റ് സിനാപ്റ്റിക് ന്യൂക്ലിയർ പ്രോട്ടീനോപ്പതികൾ 11, 12, 13 എന്നിവയുമായി ബന്ധപ്പെട്ടതാണ്.അനുകൂലമായ ഇലക്‌ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് ഇടപെടലുകൾ കാരണം ടൗ സ്വയമേവ ലായനി/സൈറ്റോപ്ലാസത്തിൽ നിന്ന് വേർപിരിയുന്നതായി കാണിക്കുന്നു.പ്രകൃതിയിലെ പല ബയോമോളിക്യുലാർ കണ്ടൻസേറ്റുകൾക്ക് പിന്നിലെ ചാലകശക്തിയും ഇത്തരത്തിലുള്ള നോൺ-സ്പെസിഫിക് ഇന്ററാക്ഷൻ ആണെന്നും നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്15.ഒരു ടൗ പ്രോട്ടീന്റെ കാര്യത്തിൽ, ഇലക്ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് അഗ്രഗേഷൻ ലളിതമായ അഗ്രഗേഷൻ വഴി രൂപം കൊള്ളുന്നു, അതിൽ പ്രോട്ടീന്റെ വിപരീത ചാർജ്ജുള്ള പ്രദേശങ്ങൾ പിളർപ്പ് പ്രക്രിയയെ ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്നു, അല്ലെങ്കിൽ ആർഎൻഎ പോലുള്ള നെഗറ്റീവ് ചാർജ്ജ് പോളിമറുകളുമായുള്ള പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിലൂടെ സങ്കീർണ്ണമായ സംയോജനത്തിലൂടെ.
അടുത്തിടെ, α-synuclein (αS), പിഡിയിലും മറ്റ് ന്യൂറോ ഡിജെനറേറ്റീവ് രോഗങ്ങളിലും മൊത്തത്തിൽ synucleinopathy17,18 എന്നറിയപ്പെടുന്ന അമിലോയിഡ് IDP, ദ്രാവകം പോലെയുള്ള സ്വഭാവമുള്ള പ്രോട്ടീൻ കണ്ടൻസേറ്റുകളിൽ കേന്ദ്രീകരിച്ചിരിക്കുന്ന സെല്ലുലാർ, അനിമൽ മോഡലുകളിൽ 19,20 പ്രദർശിപ്പിച്ചിട്ടുണ്ട്.പ്രധാനമായും ഹൈഡ്രോഫോബിക് ഇടപെടലുകളിലൂടെ ലളിതമായ അഗ്രഗേഷൻ വഴിയാണ് αS LLPS-ന് വിധേയമാകുന്നതെന്ന് ഇൻ വിട്രോ പഠനങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്, എന്നിരുന്നാലും ഈ പ്രക്രിയയ്ക്ക് അസാധാരണമാംവിധം ഉയർന്ന പ്രോട്ടീൻ സാന്ദ്രതയും വിചിത്രമായ നീണ്ട ഇൻകുബേഷൻ സമയങ്ങളും ആവശ്യമാണ്.വിവോയിൽ നിരീക്ഷിക്കപ്പെടുന്ന αS അടങ്ങിയ കണ്ടൻസേറ്റുകൾ ഇതാണോ മറ്റ് LLPS പ്രക്രിയകൾ വഴി രൂപപ്പെട്ടതാണോ എന്നത് പരിഹരിക്കപ്പെടാത്ത ഒരു പ്രധാന പ്രശ്നമായി തുടരുന്നു.അതുപോലെ, പിഡിയിലെയും മറ്റ് സിന്യൂക്ലിനോപ്പതികളിലെയും ന്യൂറോണുകളിൽ αS അമിലോയിഡ് അഗ്രഗേഷൻ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെങ്കിലും, αS ഇൻട്രാ സെല്ലുലാർ അമിലോയിഡ് അഗ്രഗേഷന് വിധേയമാകുന്നതിന്റെ കൃത്യമായ സംവിധാനം വ്യക്തമല്ല, കാരണം ഈ പ്രോട്ടീന്റെ അമിതമായ എക്സ്പ്രഷൻ ഈ പ്രക്രിയയെ സ്വയം പ്രേരിപ്പിക്കുന്നതായി തോന്നുന്നില്ല.സെല്ലുലാർ αS അമിലോയിഡ് അസംബ്ലികളുടെ പുനരുൽപ്പാദനത്തിന് ചില സെല്ലുലാർ ലൊക്കേഷനുകൾ അല്ലെങ്കിൽ മൈക്രോ എൻവയോൺമെന്റുകൾ ആവശ്യമാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്ന അധിക സെല്ലുലാർ കേടുപാടുകൾ പലപ്പോഴും ആവശ്യമാണ്.പ്രത്യേകിച്ച് അഗ്രഗേഷൻ സാധ്യതയുള്ള ഒരു സെല്ലുലാർ പരിതസ്ഥിതി പ്രോട്ടീൻ കണ്ടൻസേറ്റുകളുടെ ഉൾഭാഗമായിരിക്കാം 23 .
കൗതുകകരമെന്നു പറയട്ടെ, പാർക്കിൻസൺസ് രോഗവും മറ്റ് സിന്യൂക്ലിനോപ്പതികളും ഉള്ള മനുഷ്യരിൽ αS ഉം tau ഉം സഹ-പ്രാദേശികവൽക്കരിക്കപ്പെടുന്നതായി കണ്ടെത്തി, കൂടാതെ 26,27 പ്രോട്ടീനുകൾ തമ്മിലുള്ള ഒരു സമന്വയ രോഗബന്ധം പരീക്ഷണങ്ങൾ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തിട്ടുണ്ട്. ന്യൂറോ ഡിജനറേറ്റീവ് രോഗങ്ങളിൽ tau.അസുഖം.വിട്രോയിലും vivo 28,29 ലും αS ഉം tau ഉം പരസ്പരം സംവദിക്കുകയും പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നതായി കണ്ടെത്തി, കൂടാതെ ഈ രണ്ട് പ്രോട്ടീനുകൾ അടങ്ങിയ വൈവിധ്യമാർന്ന അഗ്രഗേറ്റുകൾ synucleinopathies 30 ഉള്ള രോഗികളുടെ തലച്ചോറിൽ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്.എന്നിരുന്നാലും, αS ഉം tau ഉം തമ്മിലുള്ള പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിന്റെ തന്മാത്രാ അടിസ്ഥാനത്തെക്കുറിച്ചും അതിന്റെ കോ-അഗ്രഗേഷന്റെ സംവിധാനത്തെക്കുറിച്ചും വളരെക്കുറച്ചേ അറിയൂ.പോസിറ്റീവ് ചാർജുള്ള അവശിഷ്ടങ്ങളാൽ സമ്പുഷ്ടമായ αS ന്റെ ഉയർന്ന നെഗറ്റീവ് ചാർജ്ജ് ഉള്ള സി-ടെർമിനൽ മേഖലയ്ക്കും ടൗവിന്റെ സെൻട്രൽ പ്രോലൈൻ സമ്പന്നമായ പ്രദേശത്തിനും ഇടയിലുള്ള ഒരു ഇലക്ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് ആകർഷണത്തിലൂടെ αS ടൗയുമായി ഇടപഴകുന്നതായി റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്.
ഈ പഠനത്തിൽ, പോളി-എൽ-ലൈസിൻ (pLK) പോലുള്ള മറ്റ് പോസിറ്റീവ് ചാർജുള്ള പോളിപെപ്റ്റൈഡുകളുമായുള്ള പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമായി, ടൗ പ്രോട്ടീന്റെ സാന്നിധ്യത്തിൽ ഇലക്‌ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് കോംപ്ലക്സ് കണ്ടൻസേഷൻ വഴി αS ന് തുള്ളികളായി വിഘടിക്കാൻ കഴിയുമെന്ന് ഞങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു.αS ഡ്രോപ്ലെറ്റ് നെറ്റ്‌വർക്കിനുള്ള ഒരു സ്കാർഫോൾഡ് തന്മാത്രയായി പ്രവർത്തിക്കുന്നു.ഇലക്‌ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് αS കോസർവേറ്റുകളുടെ പക്വത പ്രക്രിയയിൽ ശ്രദ്ധേയമായ വ്യത്യാസങ്ങൾ ഞങ്ങൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുണ്ട്, അവ കോസർവേറ്റ് നെറ്റ്‌വർക്കിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന പ്രോട്ടീനുകളുടെ പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിന്റെ വാലൻസിയിലും ശക്തിയിലും ഉള്ള വ്യത്യാസങ്ങളുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു.രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, ദീർഘകാല ദ്രാവക കോസർവേറ്റുകളിൽ αS, ടൗ അമിലോയിഡ് പ്രോട്ടീനുകൾ എന്നിവയുടെ കോ-അഗ്രഗേഷൻ ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു, അത്തരം കോസർവേറ്റുകളിൽ ഈ രണ്ട് പ്രോട്ടീനുകളുടെയും സംയോജനത്തിലേക്ക് നയിക്കുന്ന ചില പ്രധാന ഘടകങ്ങൾ ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി.രോഗ-നിർദ്ദിഷ്‌ട ഉൾപ്പെടുത്തലുകളിൽ രണ്ട് പ്രോട്ടീനുകളുടെ കൊളോക്കലൈസേഷന്റെ അടിസ്ഥാനത്തിലുള്ള ഒരു തന്മാത്രാ സംവിധാനമായ ഈ പ്രക്രിയയെ ഞങ്ങൾ ഇവിടെ വിശദമായി വിവരിക്കുന്നു.
αS-ന് ന്യൂട്രൽ pH-ൽ (ചിത്രം 1a) ഉയർന്ന അയോണിക് സി-ടെർമിനൽ ടെയിൽ ഉണ്ട്, പോളിക്കേഷനിക് ഡിസോർഡേഡ് പോളിപെപ്റ്റൈഡ് തന്മാത്രകളുള്ള ഇലക്ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് കോംപ്ലക്സുകളുടെ ഘനീഭവിക്കുന്നതിലൂടെ ഇതിന് LLPS-ന് വിധേയമാകുമെന്ന് ഞങ്ങൾ അനുമാനിക്കുന്നു.ന്യൂട്രൽ pH 32-ൽ പോസിറ്റീവ് ചാർജുള്ളതും ക്രമരഹിതവുമായ പോളിമെറിക് സ്വഭാവം ഉള്ളതിനാൽ ഞങ്ങൾ 100-റെസിഡ്യൂ പോളി-എൽ-ലൈസിൻ (pLK) ഒരു ആരംഭ മോഡൽ തന്മാത്രയായി ഉപയോഗിച്ചു. ആദ്യം, സൊല്യൂഷൻ NMR സ്പെക്ട്രോസ്കോപ്പി വഴി pLK αS-ന്റെ Ct ഡൊമെയ്‌നുമായി സംവദിക്കുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ സ്ഥിരീകരിച്ചു. (ചിത്രം 1 ബി) വർദ്ധിച്ചുവരുന്ന αS:pLK മോളാർ അനുപാതങ്ങളുടെ സാന്നിധ്യത്തിൽ 13C/15N-ലേബൽ ചെയ്ത αS ഉപയോഗിക്കുന്നു.αS-ന്റെ Ct-ഡൊമെയ്‌നുമായുള്ള pLK-യുടെ പ്രതിപ്രവർത്തനം രാസമാറ്റത്തിന്റെ അസ്വസ്ഥതകളിലും പ്രോട്ടീന്റെ ഈ മേഖലയിലെ പീക്ക് തീവ്രത കുറയുന്നതിലും പ്രകടമാകുന്നു.രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, ഞങ്ങൾ ഏകദേശം αS സാന്ദ്രതയിൽ pLK-യുമായി αS കലർത്തുമ്പോൾ.പോളിയെത്തിലീൻ ഗ്ലൈക്കോൾ (5-15% PEG-8) സാന്നിധ്യത്തിൽ 5-25 µM (സാധാരണ LLPS ബഫർ: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) ഞങ്ങൾ ഉടൻ തന്നെ പ്രോട്ടീൻ രൂപീകരണത്തിന്റെ വിശാലമായ ഒരു മേഖലയിലൂടെ കടന്നുപോയി. .ഫ്ലൂറസെൻസ് (WF), ബ്രൈറ്റ്-ഫീൽഡ് (BF) മൈക്രോസ്കോപ്പി (ചിത്രം 1c) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് തുള്ളികൾ നിരീക്ഷിച്ചു.സാന്ദ്രീകൃത αS (1 µM AlexaFluor488-ലേബൽ αS, AF488-αS ചേർത്തു) അടങ്ങുന്ന 1-5 µm തുള്ളികൾ, അവയുടെ ഇലക്ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് ഗുണങ്ങൾ 10% 1,6-ഹെക്സനേഡിയോൾ (1,6-HD) വരെയും അതിന്റെ NaCl സാന്ദ്രതയിലെ വർദ്ധനവ് (ചിത്രം 1c).αS/pLK ഇലക്‌ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് കോംപ്ലക്‌സിന്റെ കോസർവേറ്റുകളുടെ ദ്രാവകം പോലെയുള്ള സ്വഭാവം, മില്ലിസെക്കൻഡുകൾക്കുള്ളിൽ സംയോജിപ്പിക്കാനുള്ള അവയുടെ കഴിവ് വഴി തെളിയിക്കപ്പെടുന്നു (ചിത്രം 1d).ടർബിഡിമെട്രി ഉപയോഗിച്ച്, ഈ സാഹചര്യങ്ങളിൽ തുള്ളികളുടെ രൂപീകരണം ഞങ്ങൾ കണക്കാക്കി, അതിന്റെ സ്ഥിരതയുമായി ബന്ധപ്പെട്ട പ്രധാന ഇടപെടലിന്റെ ഇലക്ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് സ്വഭാവം സ്ഥിരീകരിച്ചു (ചിത്രം 1 ഇ), കൂടാതെ LLPS പ്രക്രിയയിൽ വിവിധ പോളിമർ അനുപാതങ്ങളുടെ പ്രഭാവം വിലയിരുത്തി (ചിത്രം 1f).പോളിമർ അനുപാതങ്ങളുടെ വിശാലമായ ശ്രേണിയിൽ തുള്ളി രൂപീകരണം നിരീക്ഷിക്കപ്പെടുന്നുണ്ടെങ്കിലും, pLK αS-ൽ കൂടുതലാകുമ്പോൾ പ്രക്രിയ വളരെ അനുകൂലമാണ്.രാസപരമായി വ്യത്യസ്തമായ ഡിസ്പ്ലേസിംഗ് ഏജന്റ് dextran-70 (70 kDa) ഉപയോഗിച്ചോ അല്ലെങ്കിൽ ഗ്ലാസ് സ്ലൈഡ് ഡ്രോപ്പുകൾ, വിവിധ വസ്തുക്കളുടെ മൈക്രോപ്ലേറ്റ് കിണറുകൾ, എപ്പൻഡോർഫ് അല്ലെങ്കിൽ ക്വാർട്സ് കാപ്പിലറികൾ എന്നിവയുൾപ്പെടെ വിവിധ സാമ്പിൾ ഫോർമാറ്റുകൾ ഉപയോഗിച്ചോ LLP-കൾ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്.
ഈ പഠനത്തിൽ ഉപയോഗിച്ച WT-αS, ΔCt-αS വേരിയന്റുകളിലെ വിവിധ പ്രോട്ടീൻ മേഖലകളുടെ ഒരു സ്കീമാറ്റിക് പ്രാതിനിധ്യം.ആംഫിപതിക് എൻ-ടെർമിനൽ ഡൊമെയ്ൻ, ഹൈഡ്രോഫോബിക് അമിലോയിഡ്-ഫോർമിംഗ് (എൻഎസി) മേഖല, നെഗറ്റീവ് ചാർജുള്ള സി-ടെർമിനൽ ഡൊമെയ്ൻ എന്നിവ യഥാക്രമം നീല, ഓറഞ്ച്, ചുവപ്പ് നിറങ്ങളിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.WT-αS-ന്റെ ബാക്കിയുള്ള മൊത്തം ചാർജ് (NCPR) മാപ്പ് കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.b മാക്രോമോളികുലാർ ക്ലമ്പുകളുടെ അഭാവത്തിൽ αS/pLK പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിന്റെ NMR വിശകലനം.pLK സാന്ദ്രത വർദ്ധിക്കുന്നതിനനുസരിച്ച് (αS:pLK മോളാർ അനുപാതം 1:0.5, 1:1.5, 1:10 എന്നിവ യഥാക്രമം ഇളം പച്ച, പച്ച, കടും പച്ച എന്നിവയിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു).c Coacervate αS/pLK (മോളാർ അനുപാതം 1:10) 25 µM-ൽ (1 µM AF488-ലേബൽ ചെയ്ത αS അല്ലെങ്കിൽ WF ഇമേജിംഗിനായി Atto647N-ലേബൽ ചെയ്ത pLK) LLPS ബഫറിൽ (മുകളിൽ) അല്ലെങ്കിൽ 500 മില്ലീമീറ്ററിന് ശേഷം NaCl (500 mM ന് ശേഷം) % 1,6-ഹെക്സനേഡിയോൾ (1,6-HD; താഴെ വലത്).സ്കെയിൽ ബാർ = 20 µm.d 25 μM സാന്ദ്രതയിൽ αS/pLK (മോളാർ അനുപാതം 1:10) ന്റെ BF ഡ്രോപ്ലെറ്റ് ഫ്യൂഷന്റെ പ്രതിനിധി മൈക്രോസ്കോപ്പിക് ഇമേജുകൾ;അമ്പടയാളങ്ങൾ വ്യക്തിഗത തുള്ളികൾ (ചുവപ്പ്, മഞ്ഞ അമ്പുകൾ) ഒരു പുതിയ ഡ്രോപ്പിലേക്ക് (ഓറഞ്ച് അമ്പടയാളം) 200 ms ഉള്ളിൽ ലയിപ്പിക്കുന്നതിനെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു) .സ്കെയിൽ ബാർ = 20 µm.25 µM αS-ൽ 500 mM NaCl അല്ലെങ്കിൽ 10% 1,6-HD ചേർക്കുന്നതിന് മുമ്പും ശേഷവും LLPS ബഫറിൽ e ലൈറ്റ് സ്‌കാറ്ററിംഗ് (350 nm-ൽ) αS/pLK അഗ്രഗേഷൻ (N = 3 സാമ്പിൾ പകർപ്പുകൾ, ശരാശരി, സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷനും സൂചിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു).25 μM αS-ൽ αS:pLK മോളാർ അനുപാതം (N = 3 സാമ്പിൾ പകർപ്പുകൾ, ശരാശരി, സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷൻ എന്നിവയും സൂചിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു) 25 μM αS-ൽ αS/pLK അഗ്രഗേഷന്റെ f BF ഇമേജും (മുകളിൽ) ലൈറ്റ് സ്‌കാറ്ററിംഗ് വിശകലനവും (350 nm, താഴെ).സ്കെയിൽ ബാർ = 10 µm.ഒരു ചിത്രത്തിലെ സ്കെയിൽ ബാർ ഒരു പാനലിലെ എല്ലാ ചിത്രങ്ങളുടെയും സ്കെയിൽ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.റോ ഡാറ്റ ഫയലുകളുടെ രൂപത്തിലാണ് റോ ഡാറ്റ നൽകിയിരിക്കുന്നത്.
αS/pLK ഇലക്‌ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് കോംപ്ലക്‌സ് കണ്ടൻസേഷന്റെ നിരീക്ഷണങ്ങളും tau31 യുമായുള്ള നേരിട്ടുള്ള ഇടപെടലിലൂടെ tau/RNA കണ്ടൻസേറ്റിന്റെ ഒരു ക്ലയന്റ് തന്മാത്രയായി αS-ന്റെ മുൻ നിരീക്ഷണങ്ങളും അടിസ്ഥാനമാക്കി, αS ഉം tau യും RNA ഇല്ലാത്തപ്പോൾ ലായകവുമായി വേർതിരിക്കാമെന്ന് ഞങ്ങൾ അനുമാനിക്കുന്നു. ഘനീഭവിക്കൽ.ഇലക്‌ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് കോംപ്ലക്സുകളിലൂടെ, αS എന്നത് αS/Tau കോസർവേറ്റുകളിലെ സ്‌കാഫോൾഡ് പ്രോട്ടീനാണ് (ചിത്രം 2e-ലെ ടൗ ചാർജ് ഡിസ്ട്രിബ്യൂഷൻ കാണുക).LLPS ബഫറിൽ 10 μM αS ഉം 10 μM Tau441 ഉം (യഥാക്രമം 1 μM AF488-αS, 1 μM Atto647N-Tau എന്നിവ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു) ഒരുമിച്ച് കലർന്നപ്പോൾ, WF മൈക്രോസ്കോപ്പി കാണുന്നത് പോലെ, രണ്ട് പ്രോട്ടീനുകളും അടങ്ങിയ പ്രോട്ടീൻ അഗ്രഗേറ്റുകൾ അവ എളുപ്പത്തിൽ രൂപപ്പെടുത്തുന്നതായി ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു.(ചിത്രം 2a).തുള്ളികളിലെ രണ്ട് പ്രോട്ടീനുകളുടെ കൊളോക്കലൈസേഷൻ കോൺഫോക്കൽ (സിഎഫ്) മൈക്രോസ്കോപ്പി (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 1 എ) വഴി സ്ഥിരീകരിച്ചു.dextran-70 ഒരു അഗ്രഗേഷൻ ഏജന്റായി ഉപയോഗിച്ചപ്പോൾ സമാനമായ സ്വഭാവം നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 1c).FITC-ലേബൽ ചെയ്‌ത PEG അല്ലെങ്കിൽ dextran ഉപയോഗിച്ച്, രണ്ട് ക്രൗഡിംഗ് ഏജന്റുമാരും സാമ്പിളുകളിലുടനീളം തുല്യമായി വിതരണം ചെയ്യപ്പെട്ടതായി ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി, വേർതിരിവോ കൂട്ടുകെട്ടോ കാണിക്കുന്നില്ല (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 1d).പകരം, മറ്റ് LLP സിസ്റ്റങ്ങളിൽ കാണുന്നത് പോലെ, PEG മുൻഗണനാപരമായ സ്ഥിരതയുള്ള ക്രൗഡിംഗ് ഏജന്റായതിനാൽ, ഈ സിസ്റ്റത്തിൽ അവർ മാക്രോമോളിക്യുലാർ ക്രൗഡിംഗ് ഇഫക്റ്റുകൾ വഴി ഘട്ടം വേർതിരിക്കുന്നത് പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നു എന്നാണ് ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നത്.ഈ പ്രോട്ടീൻ സമ്പുഷ്ടമായ തുള്ളികൾ NaCl (1 M) ലേക്ക് സെൻസിറ്റീവ് ആയിരുന്നു, എന്നാൽ 1,6-HD (10% v/v) യോട് അല്ല, അവയുടെ ഇലക്ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് ഗുണങ്ങളെ സ്ഥിരീകരിക്കുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 2a, b).ബിഎഫ് മൈക്രോസ്കോപ്പി (ചിത്രം 2 ബി) ഉപയോഗിച്ച് മില്ലിസെക്കൻഡ് ലയിപ്പിക്കുന്ന തുള്ളി സംഭവങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചുകൊണ്ട് അവരുടെ ദ്രാവക സ്വഭാവം സ്ഥിരീകരിച്ചു.
LLPS ബഫറിലെ αS/Tau441 കോസർവേറ്റുകളുടെ ഒരു കൺഫോക്കൽ (CF) മൈക്രോസ്കോപ്പി ഇമേജുകൾ (ഓരോ പ്രോട്ടീനിന്റെയും 10 μM, AF488-ലേബൽ ചെയ്ത αS ന്റെ 0.5 μM, Atto647N-ലേബൽ ചെയ്ത Tau441).b αS/Tau441 ഡ്രോപ്ലെറ്റ് ഫ്യൂഷൻ ഇവന്റുകളുടെ (ഓരോ പ്രോട്ടീനിനും 10 μM) റെപ്രസന്റേറ്റീവ് ഡിഫറൻഷ്യൽ ഇന്റർഫെറൻസ് കോൺട്രാസ്റ്റ് (DIC) ഇമേജുകൾ.c 50 µM αS ന്റെ അഭാവത്തിൽ (ഇടത്) അല്ലെങ്കിൽ സാന്നിധ്യത്തിൽ (വലത്) Tau441 LLPS (0–15 µM) പ്രകാശ വിസരണം (350 nm ൽ) അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഘട്ട ഡയഗ്രം.ഊഷ്മളമായ നിറങ്ങൾ കൂടുതൽ വിസരണം സൂചിപ്പിക്കുന്നു.d വർദ്ധിച്ചുവരുന്ന αS സാന്ദ്രതയോടുകൂടിയ αS/Tau441 LLPS സാമ്പിളുകളുടെ പ്രകാശ വിസരണം (Tau441 at 5 µM, N = 2-3 സാമ്പിൾ ആവർത്തനങ്ങൾ സൂചിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു).e ഈ പഠനത്തിൽ ഉപയോഗിച്ചിരിക്കുന്ന ചില ടൗ പ്രോട്ടീൻ വേരിയന്റുകളുടെയും പ്രോട്ടീന്റെ വിവിധ മേഖലകളുടെയും സ്കീമാറ്റിക് പ്രാതിനിധ്യം: നെഗറ്റീവ് ചാർജ്ജ് ചെയ്ത എൻ-ടെർമിനൽ ഡൊമെയ്ൻ (ചുവപ്പ്), പ്രോലൈൻ-റിച്ച് റീജിയൻ (നീല), മൈക്രോട്യൂബ്-ബൈൻഡിംഗ് ഡൊമെയ്ൻ (എംടിബിഡി, ഓറഞ്ചിൽ ഹൈലൈറ്റ് ചെയ്തിരിക്കുന്നു), കൂടാതെ അമിലോയിഡ് രൂപപ്പെടുന്ന ജോഡി സർപ്പിളം.MTBD (ചാരനിറം) ഉള്ളിൽ സ്ഥിതി ചെയ്യുന്ന ഫിലമെന്റ് മേഖലകൾ (PHF).Tau441-ന്റെ നെറ്റ് ചാർജ് പെർ റെസിഡ്യൂ (NCPR) മാപ്പ് കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.f 1 µM AF488-ലേബൽ ചെയ്‌ത αS ഉം Atto647N-ലേബൽ ചെയ്‌ത ΔNt-ഉം ഉപയോഗിക്കുന്നു, 1 µM AF488-ലേബൽ ചെയ്‌ത αS അല്ലെങ്കിൽ ΔCt-αS ഉപയോഗിച്ച് ΔNt-Tau സാന്നിധ്യത്തിൽ (മുകളിൽ, 10 µ5 പ്രോട്ടീനിന്, ഒരു ബോട്ടിന് 10 µ0 ) ) LLPS അല്ലെങ്കിൽ K18 ബഫറിൽ ഘനീഭവിച്ച WF-ന്റെ മൈക്രോഗ്രാഫുകൾ.ഒരു ചിത്രത്തിലെ സ്കെയിൽ ബാറുകൾ ഒരു പാനലിലെ എല്ലാ ചിത്രങ്ങളുടെയും സ്കെയിലിനെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു (എ, ബി, എഫ് പാനലുകൾക്ക് 20 µm).സി, ഡി പാനലുകൾക്കുള്ള റോ ഡാറ്റ റോ ഡാറ്റ ഫയലുകളായി നൽകിയിരിക്കുന്നു.
ഈ LLPS പ്രക്രിയയിൽ αS-ന്റെ പങ്ക് പരിശോധിക്കുന്നതിനായി, NaCl ന്റെ വർദ്ധിച്ചുവരുന്ന സാന്ദ്രത ഉപയോഗിച്ച് നെഫെലോമെട്രി വഴി തുള്ളി സ്ഥിരതയിൽ αS-ന്റെ സ്വാധീനം ഞങ്ങൾ ആദ്യം അന്വേഷിച്ചു (ചിത്രം 2c).αS അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന സാമ്പിളുകളിൽ ഉപ്പ് സാന്ദ്രത കൂടുന്തോറും, പ്രകാശം പരത്തുന്ന മൂല്യങ്ങൾ (350 nm-ൽ), ഈ LLPS സിസ്റ്റത്തിൽ αS-ന്റെ സ്ഥിരതയുള്ള പങ്ക് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.αS ഏകാഗ്രത (അതിനാൽ αS:Tau441 അനുപാതം) ഏകദേശം വർദ്ധിപ്പിച്ചുകൊണ്ട് സമാനമായ ഒരു പ്രഭാവം നിരീക്ഷിക്കാവുന്നതാണ്.ടൗ കോൺസൺട്രേഷനുമായി (5 µM) 10 മടങ്ങ് വർദ്ധനവ് (ചിത്രം 2d).കോസർവേറ്റുകളിൽ αS ഒരു സ്‌കാഫോൾഡ് പ്രോട്ടീനാണെന്ന് തെളിയിക്കാൻ, എൽഎൽപിഎസ്-തടസ്സപ്പെട്ട ടൗ മ്യൂട്ടന്റിന്റെ സ്വഭാവം അന്വേഷിക്കാൻ ഞങ്ങൾ തീരുമാനിച്ചു, അതിൽ ΔNt-Tau എന്ന് വിളിക്കപ്പെടുന്ന നെഗറ്റീവ് ചാർജുള്ള N-ടെർമിനൽ മേഖല (അവശിഷ്ടങ്ങൾ 1-150, ചിത്രം 2e കാണുക) ഇല്ല.ΔNt-Tau തന്നെ LLPS-ന് വിധേയമായിട്ടില്ലെന്ന് WF മൈക്രോസ്കോപ്പിയും നെഫെലോമെട്രിയും സ്ഥിരീകരിച്ചു (ചിത്രം. 2f, സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 2d), മുമ്പ് റിപ്പോർട്ടുചെയ്തത് പോലെ 14. എന്നിരുന്നാലും, ഈ വെട്ടിച്ചുരുക്കിയ Tau വേരിയന്റിന്റെ ഡിസ്‌പേർഷൻ സൊല്യൂഷനുകളിൽ αS ചേർത്തപ്പോൾ, LLPS പ്രക്രിയ പൂർണ്ണമായി. സമാന സാഹചര്യങ്ങളിലും പ്രോട്ടീൻ സാന്ദ്രതയിലും Tau, αS എന്നിവയുടെ പൂർണ്ണ വലിപ്പത്തിലുള്ള ലായനികളുടെ ഡ്രോപ്ലെറ്റ് സാന്ദ്രതയോട് അടുത്ത് ഡ്രോപ്ലെറ്റ് ഡെൻസിറ്റി ഉപയോഗിച്ച് പുനഃസ്ഥാപിച്ചു.കുറഞ്ഞ മാക്രോമോളിക്യുലാർ ജനക്കൂട്ടത്തിന്റെ അവസ്ഥയിലും ഈ പ്രക്രിയ നിരീക്ഷിക്കാവുന്നതാണ് (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 2c).എൽഎൽപിഎസ് പ്രക്രിയയിൽ സി-ടെർമിനൽ αS മേഖലയുടെ പങ്ക്, എന്നാൽ അതിന്റെ മുഴുവൻ നീളവും അല്ല, ഒരു സി-ടെർമിനൽ വെട്ടിച്ചുരുക്കിയ αS വേരിയൻറ് ഉപയോഗിച്ച് (ΔCt-) അവശിഷ്ടങ്ങൾ 104-140 (ചിത്രം 1a) ഉപയോഗിച്ച് ഡ്രോപ്ലെറ്റ് രൂപീകരണം തടയുന്നതിലൂടെ തെളിയിക്കപ്പെട്ടു. αS) പ്രോട്ടീൻ (ചിത്രം 2f, അനുബന്ധ ചിത്രം 2d).αS, ΔNt-Tau എന്നിവയുടെ കൊളോക്കലൈസേഷൻ കോൺഫോക്കൽ ഫ്ലൂറസെൻസ് മൈക്രോസ്കോപ്പി വഴി സ്ഥിരീകരിച്ചു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 1b).
Tau441-നും αS-നും ഇടയിലുള്ള LLPS മെക്കാനിസം കൂടുതൽ പരിശോധിക്കുന്നതിന്, ഒരു അധിക Tau വേരിയന്റ് ഉപയോഗിച്ചു, അതായത് മൈക്രോട്യൂബ്-ബൈൻഡിംഗ് ഡൊമെയ്‌നിലെ (MTBD) ജോടിയാക്കിയ ഹെലിക്കൽ ഫിലമെന്റ് കോർ (PHF) ശകലം, അതിൽ നാല് സ്വഭാവ സവിശേഷതകളുള്ള ആവർത്തന ഡൊമെയ്‌നുകൾ അടങ്ങിയിട്ടുണ്ടെങ്കിൽ, ഇത് സാധാരണയായി അറിയപ്പെടുന്നു. K18 ശകലമായി (ചിത്രം 2e കാണുക).മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ-ബൈൻഡിംഗ് ഡൊമെയ്‌നിന് മുമ്പുള്ള ഒരു ശ്രേണിയിൽ പ്രോലൈൻ-സമ്പന്നമായ ഡൊമെയ്‌നിൽ സ്ഥിതി ചെയ്യുന്ന ഒരു ടൗ പ്രോട്ടീനുമായി αS മുൻഗണന നൽകുന്നുവെന്ന് അടുത്തിടെ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്.എന്നിരുന്നാലും, PHF പ്രദേശം പോസിറ്റീവ് ചാർജ്ജ് ചെയ്ത അവശിഷ്ടങ്ങളാൽ സമ്പന്നമാണ് (ചിത്രം 2e കാണുക), പ്രത്യേകിച്ച് ലൈസിൻ (15% അവശിഷ്ടങ്ങൾ), ഈ പ്രദേശവും αS/Tau സമുച്ചയത്തിന്റെ ഘനീഭവിക്കുന്നതിന് കാരണമാകുന്നുണ്ടോ എന്ന് പരിശോധിക്കാൻ ഞങ്ങളെ പ്രേരിപ്പിച്ചു.K18-ന് മാത്രം 100 μM വരെ സാന്ദ്രതയിൽ LLPS ട്രിഗർ ചെയ്യാൻ കഴിയില്ലെന്ന് ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു (15% PEG അല്ലെങ്കിൽ 20% dextran ഉള്ള LLPS ബഫർ) (ചിത്രം 2f).എന്നിരുന്നാലും, ഞങ്ങൾ 50 µM αS മുതൽ 50 µM K18 വരെ ചേർത്തപ്പോൾ, K18 ഉം αS ഉം അടങ്ങിയ പ്രോട്ടീൻ തുള്ളികളുടെ ദ്രുത രൂപീകരണം നെഫെലോമെട്രിയും (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 2d) WF മൈക്രോസ്കോപ്പിയും (ചിത്രം 2f) നിരീക്ഷിച്ചു.പ്രതീക്ഷിച്ചതുപോലെ, ΔCt-αS-ന് K18 ന്റെ LLPS സ്വഭാവം പുനഃസ്ഥാപിക്കാൻ കഴിഞ്ഞില്ല (ചിത്രം 2f).αS/ΔNt-Tau അല്ലെങ്കിൽ αS/Tau441 എന്നിവയുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ എൽഎൽപിഎസ് പ്രേരിപ്പിക്കുന്നതിന് αS/K18 അഗ്രഗേഷന് അല്പം ഉയർന്ന പ്രോട്ടീൻ സാന്ദ്രത ആവശ്യമാണെന്ന് ഞങ്ങൾ ശ്രദ്ധിക്കുന്നു, മറ്റ് കാര്യങ്ങൾ തുല്യമാണ്.മുമ്പ് 31 വിവരിച്ചതുപോലെ, മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ-ബൈൻഡിംഗ് ഡൊമെയ്‌നുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, പ്രോലൈൻ-റിച്ച് ടൗ ഡൊമെയ്‌നുമായുള്ള αS സി-ടെർമിനൽ മേഖലയുടെ ശക്തമായ ഇടപെടലുമായി ഇത് പൊരുത്തപ്പെടുന്നു.
αS-ന്റെ അഭാവത്തിൽ ΔNt-Tau-ന് LLPS നടത്താൻ കഴിയില്ല എന്നതിനാൽ, എൽഎൽപിഎസ് സിസ്റ്റങ്ങളിൽ മുഴുനീള ടൗ (ഐസോടൈപ്പ്, Tau441/Tau441) ഉള്ള ലാളിത്യം കണക്കിലെടുത്ത് αS/Tau LLPS സ്വഭാവരൂപീകരണത്തിനുള്ള ഒരു മാതൃകയായി ഞങ്ങൾ ഈ Tau വേരിയന്റിനെ തിരഞ്ഞെടുത്തു.സങ്കീർണ്ണമായ (heterotypic, αS/Tau441) അഗ്രഗേഷൻ പ്രക്രിയകൾക്കൊപ്പം.αS/Tau, αS/ΔNt-Tau സിസ്റ്റങ്ങളിലെ αS അഗ്രഗേഷന്റെ അളവ് (സാന്ദ്രീകരിച്ച ഘട്ടം പ്രോട്ടീന്റെ ഭാഗമായി, fαS,c) ഞങ്ങൾ സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷനിലൂടെയും ചിതറിക്കിടക്കുന്ന ഘട്ടം SDS-PAGE വിശകലനത്തിലൂടെയും താരതമ്യം ചെയ്തു (2e കാണുക), സമാന മൂല്യങ്ങൾ കണ്ടെത്തി. എല്ലാ പ്രോട്ടീനുകൾക്കും ഒരേ സാന്ദ്രതയിൽ.പ്രത്യേകിച്ചും, αS/Tau, αS/ΔNt-Tau എന്നിവയ്‌ക്കായി ഞങ്ങൾ യഥാക്രമം fαS,c 84 ± 2%, 79 ± 7% എന്നിവ നേടി, αS ഉം tau ഉം തമ്മിലുള്ള ഹെറ്ററോടൈപ്പിക് പ്രതിപ്രവർത്തനം tau തന്മാത്രകൾ തമ്മിലുള്ള പ്രതിപ്രവർത്തനത്തേക്കാൾ മികച്ചതാണെന്ന് നിർദ്ദേശിക്കുന്നു.ഇടയിൽ.
ഫോട്ടോബ്ലീച്ചിംഗ് (FRAP) രീതിക്ക് ശേഷമുള്ള ഫ്ലൂറസെൻസ് വീണ്ടെടുക്കൽ വഴിയാണ് വിവിധ പോളിക്കേഷനുകളുമായുള്ള പ്രതിപ്രവർത്തനവും αS ചലനാത്മകതയിൽ കണ്ടൻസേഷൻ പ്രക്രിയയുടെ ഫലവും ആദ്യം പഠിച്ചത്.ഞങ്ങൾ αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau, αS/pLK കോസർവേറ്റുകൾ (100 μM αS എന്നിവ 2 μM αS AF488-αS, 100 μM Tau441 അല്ലെങ്കിൽ ΔNt-TauK എന്നിവയ്‌ക്കൊപ്പം സപ്ലിമെന്റ് ചെയ്‌തു) പരീക്ഷിച്ചു.സാമ്പിൾ ഘടകങ്ങൾ കലർത്തി ആദ്യ 30 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ ഡാറ്റ ലഭിച്ചു.പ്രതിനിധി FRAP ഇമേജുകളിൽ നിന്നും (ചിത്രം. 3a, αS/Tau441 കണ്ടൻസേഷൻ) അവയുടെ അനുബന്ധ സമയ കോഴ്‌സ് കർവുകളിൽ നിന്നും (ചിത്രം. 3b, അനുബന്ധ ചിത്രം. 3), αS ചലനാത്മകത Tau441 കോസർവേറ്റുകളുടേതുമായി വളരെ സാമ്യമുള്ളതാണെന്ന് കാണാൻ കഴിയും.കൂടാതെ ΔNt-Tau, pLK ഉപയോഗിച്ച് വളരെ വേഗതയുള്ളതാണ്.FRAP അനുസരിച്ച് കോസർവേറ്റിനുള്ളിലെ αS-നുള്ള ഡിഫ്യൂഷൻ കോഫിഫിഷ്യന്റുകൾ D = 0.013 ± 0.009 µm2/s ഉം D = 0.026 ± 0.008 µm2/s ന് ααS/Tau-44-നും N. αS/ സിസ്റ്റം.pLK, Tau, D = 0.18 ± 0.04 µm2/s, യഥാക്രമം (ചിത്രം 3c).എന്നിരുന്നാലും, ചിതറിക്കിടക്കുന്ന ഘട്ടത്തിലെ ഡിഫ്യൂഷൻ കോഫിഫിഷ്യന്റ് αS എല്ലാ ഘനീഭവിച്ച ഘട്ടങ്ങളേക്കാളും ഉയർന്ന അളവിലുള്ള നിരവധി ഓർഡറുകളാണ്, ഫ്ലൂറസെൻസ് കോറിലേഷൻ സ്പെക്ട്രോസ്കോപ്പി (എഫ്സിഎസ്, സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം കാണുക. 3 കാണുക) അതേ വ്യവസ്ഥകളിൽ (എൽഎൽപിഎസ് ബഫർ) എന്നാൽ പോളിക്കേഷനുകളുടെ അഭാവത്തിൽ നിർണ്ണയിക്കപ്പെടുന്നു. (D = 8 ± 4 µm2/s).അതിനാൽ, തന്മാത്രാ ക്രൗഡിംഗ് ഇഫക്റ്റുകൾ കാരണം ചിതറിക്കിടക്കുന്ന ഘട്ടത്തിലെ പ്രോട്ടീനുകളെ അപേക്ഷിച്ച് കോസർവേറ്റുകളിൽ αS വിവർത്തനത്തിന്റെ ചലനാത്മകത ഗണ്യമായി കുറയുന്നു, എന്നിരുന്നാലും എല്ലാ കോസർവേറ്റുകളും അവയുടെ രൂപീകരണത്തിന് ശേഷമുള്ള ആദ്യ അരമണിക്കൂറിനുള്ളിൽ ദ്രാവകരൂപത്തിലുള്ള ഗുണങ്ങൾ നിലനിർത്തുന്നു, ടൗ ഘട്ടത്തിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമായി.pLK കണ്ടൻസേറ്റിലെ വേഗതയേറിയ ചലനാത്മകത.
ഇലക്‌ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് കോസർവേറ്റുകളിലെ αS ഡൈനാമിക്‌സിന്റെ (2% AF488-ലേബൽ αS) a-c FRAP വിശകലനം.αS/Tau441 FRAP അസെയ്‌സിന്റെ ട്രിപ്ലിക്കേറ്റിലുള്ള പ്രതിനിധാന ചിത്രങ്ങൾ (a) ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു, ഇവിടെ ചുവന്ന വൃത്തങ്ങൾ വർണ്ണരഹിതമായ പ്രദേശങ്ങളെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.സ്കെയിൽ ബാർ 5 µm ആണ്.b ശരാശരി FRAP കർവുകളും (c) 5-6 (N) നായുള്ള ഡിഫ്യൂഷൻ ഗുണകങ്ങളും (D) 100 µM αS ഉപയോഗിച്ച് മൂന്ന് പരീക്ഷണങ്ങളിൽ നിന്നുള്ള വ്യത്യസ്ത തുള്ളികൾ, Tau441 (ചുവപ്പ്) അല്ലെങ്കിൽ ΔNt-Tau (നീല) അല്ലെങ്കിൽ pLK (പച്ച) എന്നിവയുടെ ഇക്വിമോളാർ സാന്ദ്രത എൽഎൽപിഎസിന്റെ പത്തിരട്ടി സാന്ദ്രത.FRAP കർവിന്റെ സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷൻ ഷേഡുള്ള നിറത്തിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.താരതമ്യത്തിനായി, ഫ്ലൂറസെൻസ് കോറിലേഷൻ സ്പെക്ട്രോസ്കോപ്പി (എഫ്‌സി‌എസ്) ഉപയോഗിച്ച് ചിതറിക്കിടക്കുന്ന ഘട്ടത്തിലെ ഡിഫ്യൂഷൻ കോഫിഫിഷ്യന്റ് αS മൂന്ന് തവണയായി നിർണ്ണയിക്കപ്പെട്ടു (കൂടുതൽ വിവരങ്ങൾക്ക് അനുബന്ധ ചിത്രം 3 ഉം രീതികളും കാണുക).d എൽഎൽപിഎസ് ബഫറിൽ 100 ​​μM TEMPOL-122-αS ന്റെ തുടർച്ചയായ X-ബാൻഡ് EPR സ്പെക്ട്ര, പോളിക്കേഷൻ ഇല്ലാതെ (കറുപ്പ്) അല്ലെങ്കിൽ 100 ​​μM Tau441 (ചുവപ്പ്) അല്ലെങ്കിൽ ΔNt-Tau (നീല) അല്ലെങ്കിൽ 1 mM pLK (പച്ച) സാന്നിധ്യത്തിൽ.ഏറ്റവും നാടകീയമായ മാറ്റങ്ങൾ സംഭവിക്കുന്ന ശക്തമായ ഫീൽഡ് ലൈനുകളുടെ ഒരു മാഗ്നിഫൈഡ് കാഴ്ച ഇൻസെറ്റ് കാണിക്കുന്നു.50 μM TEMPOL-122-αS ന്റെ ഇ ബൈൻഡിംഗ് കർവുകൾ LLPS ന്റെ അഭാവത്തിൽ (PEG ഇല്ല).നോർമലൈസ്ഡ് EPR സ്പെക്ട്രത്തിന്റെ ബാൻഡ് II (IIII/III) മായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ ബാൻഡ് III ന്റെ കുറഞ്ഞ വ്യാപ്തി Tau441 (ചുവപ്പ്), ΔNt-Tau (നീല), pLK (പച്ച) എന്നിവയുടെ മോളാർ അനുപാതങ്ങൾ വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതായി കാണിക്കുന്നു.ഓരോ വളവിലും n സമാനവും സ്വതന്ത്രവുമായ ബൈൻഡിംഗ് സൈറ്റുകളുള്ള ഒരു പരുക്കൻ ബൈൻഡിംഗ് മോഡൽ ഉപയോഗിച്ച് വർണ്ണരേഖകൾ ഡാറ്റയ്ക്ക് അനുയോജ്യമാണെന്ന് കാണിക്കുന്നു.റോ ഡാറ്റ ഫയലുകളുടെ രൂപത്തിലാണ് റോ ഡാറ്റ നൽകിയിരിക്കുന്നത്.
ഒരു പൂരകമെന്ന നിലയിൽ, ഡയറക്‌ട് സ്പിൻ ലേബലിംഗും (SDSL) തുടർച്ചയായ ഇലക്ട്രോൺ പാരാമാഗ്നെറ്റിക് റെസൊണൻസും (CW-EPR) ഉപയോഗിച്ച് വിവിധ കോസർവേറ്റുകളിലെ αS ന്റെ ചലനാത്മകത ഞങ്ങൾ അന്വേഷിച്ചു.ഈ രീതി IDP യുടെ വഴക്കവും ചലനാത്മകതയും ഒരു റിയലിസ്റ്റിക് അവശിഷ്ട റെസലൂഷൻ36,37,38 ഉപയോഗിച്ച് റിപ്പോർട്ടുചെയ്യുന്നതിന് വളരെ ഉപയോഗപ്രദമാണെന്ന് തെളിയിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്.ഇതിനായി, ഞങ്ങൾ സിംഗിൾ സിസ് മ്യൂട്ടന്റുകളിൽ സിസ്റ്റൈൻ അവശിഷ്ടങ്ങൾ നിർമ്മിക്കുകയും 4-ഹൈഡ്രോക്സി-2,2,6,6-ടെട്രാമെഥൈൽപിപെരിഡിൻ-എൻ-ഓക്സൈൽ (TEMPOL) സ്പിൻ പ്രോബ് ഉപയോഗിക്കുകയും ചെയ്തു.Maleimide ഡെറിവേറ്റീവുകൾ അവയെ ലേബൽ ചെയ്യുന്നു.കൂടുതൽ വ്യക്തമായി പറഞ്ഞാൽ, ഞങ്ങൾ TEMPOL പ്രോബുകൾ 122 അല്ലെങ്കിൽ 24 αS (TEMPOL-122-αS, TEMPOL-24-αS) സ്ഥാനത്ത് ചേർത്തു.ആദ്യ സന്ദർഭത്തിൽ, പ്രോട്ടീന്റെ സി-ടെർമിനൽ മേഖലയെ ഞങ്ങൾ ലക്ഷ്യമിടുന്നു, അത് പോളികേഷനുകളുമായുള്ള ഇടപെടലിൽ ഉൾപ്പെടുന്നു.പകരം, 24-ാം സ്ഥാനത്തിന് കണ്ടൻസേറ്റിലെ പ്രോട്ടീനുകളുടെ മൊത്തത്തിലുള്ള ചലനാത്മകതയെക്കുറിച്ചുള്ള വിവരങ്ങൾ നൽകാൻ കഴിയും.രണ്ട് സാഹചര്യങ്ങളിലും, ചിതറിക്കിടക്കുന്ന ഘട്ടത്തിലെ പ്രോട്ടീനുകൾക്കായി ലഭിച്ച ഇപിആർ സിഗ്നലുകൾ അതിവേഗം ചലിക്കുന്ന അവസ്ഥയിലെ നൈട്രോക്സൈഡ് റാഡിക്കലുകളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു.tau അല്ലെങ്കിൽ pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 അല്ലെങ്കിൽ ΔNt-Tau 1:1 അല്ലെങ്കിൽ pLK 1:10 എന്ന അനുപാതത്തിൽ) സാന്നിധ്യത്തിൽ ഘട്ടം വേർപെടുത്തിയ ശേഷം, ആപേക്ഷിക പീക്ക് തീവ്രതയിൽ വർദ്ധനവ് നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു. αS ന്റെ EPR സ്പെക്ട്രം.നേർപ്പിച്ച ഘട്ടത്തിലെ പ്രോട്ടീനുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ തുള്ളികളിലെ αS റീഓറിയന്റേഷൻ ഗതിവിഗതികൾ കുറഞ്ഞതായി സൂചിപ്പിക്കുന്നു (ചിത്രം. 3d, അനുബന്ധ ചിത്രം. 4a).122-ാം സ്ഥാനത്താണ് ഈ മാറ്റങ്ങൾ കൂടുതൽ പ്രകടമാകുന്നത്. 24-ാം സ്ഥാനത്ത് pLK-യുടെ സാന്നിധ്യം അന്വേഷണത്തിന്റെ ചലനാത്മകതയെ ബാധിച്ചില്ല, 122-ൽ സ്പെക്ട്രൽ രേഖയുടെ ആകൃതി ഗണ്യമായി മാറി (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 4a).സ്പിൻ-ലേബൽ ചെയ്ത IDP38,39 ന്റെ ചലനാത്മകത വിവരിക്കാൻ സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്ന ഐസോട്രോപിക് മോഡൽ (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 5a) ഉപയോഗിച്ച് രണ്ട് αS/പോളിക്കേഷൻ സിസ്റ്റങ്ങളുടെ സ്ഥാനത്ത് 122-ൽ സ്പെക്ട്രയെ മാതൃകയാക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശ്രമിച്ചപ്പോൾ, പരീക്ഷണാത്മക സ്പെക്ട്ര പുനർനിർമ്മിക്കാൻ ഞങ്ങൾക്ക് കഴിഞ്ഞില്ല..24 സ്പിൻ കോൺട്രാസ്റ്റുകളുടെ സ്ഥാനത്തിന്റെ സ്പെക്ട്രൽ സിമുലേഷൻ (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 5a).പോളിക്കേഷനുകളുടെ സാന്നിധ്യത്തിൽ αS-ന്റെ സി-ടെർമിനൽ മേഖലയുടെ സ്പിൻ കോൺഫിഗറേഷനുകളുടെ സ്ഥലത്ത് മുൻഗണനാ സ്ഥാനങ്ങൾ ഉണ്ടെന്ന് ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.പരീക്ഷണാത്മക EPR വ്യവസ്ഥകൾക്ക് കീഴിലുള്ള ഘനീഭവിച്ച ഘട്ടത്തിൽ αS ന്റെ അംശം പരിഗണിക്കുമ്പോൾ (യഥാക്രമം αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau, αS/pLK എന്നിവയ്‌ക്ക് 84 ± 2%, 79 ± 7%, 47 ± 4%, Sup-കാണുക. ഡാറ്റാ അനാലിസിസ് സിയുടെ ചിത്രം. 2e), EPR രീതി കണ്ടെത്തിയ വിശാലത പ്രധാനമായും αS ന്റെ സി-ടെർമിനൽ മേഖലയുടെ വിവിധ പോളിക്കേഷനുകളുമായുള്ള പ്രതിപ്രവർത്തനത്തെ പ്രതിഫലിപ്പിക്കുന്നതായി കാണാൻ കഴിയും. αS), പ്രോട്ടീൻ കണ്ടൻസേഷൻ അല്ല.മൈക്രോവിസ്കോസിറ്റിയുടെ വർദ്ധനവ് അന്വേഷണത്തിൽ നിരീക്ഷിക്കപ്പെടുന്നു.പ്രതീക്ഷിച്ചതുപോലെ, 1 M NaCl മിശ്രിതത്തിലേക്ക് ചേർത്തപ്പോൾ LLPS ഒഴികെയുള്ള വ്യവസ്ഥകളിൽ പ്രോട്ടീന്റെ EPR സ്പെക്ട്രം പൂർണ്ണമായും പുനഃസ്ഥാപിക്കപ്പെട്ടു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 4b).മൊത്തത്തിൽ, CW-EPR കണ്ടെത്തിയ മാറ്റങ്ങൾ ഘനീഭവിച്ച ഘട്ടത്തിലെ വിവിധ പോളിക്കേഷനുകളുമായുള്ള αS-ന്റെ C-ടെർമിനൽ മേഖലയുടെ പ്രതിപ്രവർത്തനത്തെയാണ് പ്രധാനമായും പ്രതിഫലിപ്പിക്കുന്നതെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ സൂചിപ്പിക്കുന്നു, കൂടാതെ ഈ ഇടപെടൽ Tau യേക്കാൾ ശക്തമാണ് pLK-യുമായി.
കോസർവേറ്റിലെ പ്രോട്ടീനുകളെക്കുറിച്ചുള്ള കൂടുതൽ ഘടനാപരമായ വിവരങ്ങൾ ലഭിക്കുന്നതിന്, ലായനിയിൽ NMR ഉപയോഗിച്ച് LLPS സിസ്റ്റം പഠിക്കാൻ ഞങ്ങൾ തീരുമാനിച്ചു.എന്നിരുന്നാലും, ചിതറിക്കിടക്കുന്ന ഘട്ടത്തിൽ അവശേഷിക്കുന്ന αS അംശം മാത്രമേ ഞങ്ങൾക്ക് കണ്ടെത്താനാകൂ, ഇത് കോസർവേറ്റിനുള്ളിലെ പ്രോട്ടീൻ ചലനാത്മകത കുറയുന്നതും NMR വിശകലനത്തിൽ ലായനിയുടെ അടിയിൽ ഇടതൂർന്ന ഘട്ടവും മൂലമാകാം.NMR (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 5c, d) ഉപയോഗിച്ച് LLPS സാമ്പിളിന്റെ ചിതറിക്കിടക്കുന്ന ഘട്ടത്തിൽ ശേഷിക്കുന്ന പ്രോട്ടീന്റെ ഘടനയും ചലനാത്മകതയും ഞങ്ങൾ വിശകലനം ചെയ്തപ്പോൾ, pLK, ΔNt-Tau എന്നിവയുടെ സാന്നിധ്യത്തിൽ പ്രോട്ടീൻ ഏതാണ്ട് സമാനമായി പ്രവർത്തിക്കുന്നതായി ഞങ്ങൾ ശ്രദ്ധിച്ചു. പ്രോട്ടീൻ നട്ടെല്ലിന്റെ ദ്വിതീയ ഘടനയിലും ചലനാത്മകതയിലും ഉള്ളവ, ദ്വിതീയ കെമിക്കൽ ഷിഫ്റ്റ്, R1ρ റിലാക്സേഷൻ എന്നിവയെക്കുറിച്ചുള്ള പരീക്ഷണങ്ങളിലൂടെ വെളിപ്പെടുത്തി.NMR ഡാറ്റ കാണിക്കുന്നത്, αS-ന്റെ C-ടെർമിനസ് അതിന്റെ ക്രമരഹിതമായ സ്വഭാവം നിലനിർത്തുമ്പോൾ, മറ്റ് പ്രോട്ടീൻ ശ്രേണികളെപ്പോലെ, പോളിക്കേഷനുകളുമായുള്ള അതിന്റെ ഇടപെടലുകൾ കാരണം അനുരൂപമായ വഴക്കം ഗണ്യമായി നഷ്ടപ്പെടുന്നു.
TEMPOL-122-αS ഘനീഭവിച്ച ഘട്ടത്തിൽ നിരീക്ഷിച്ച CW-EPR സിഗ്നൽ വിശാലമാക്കുന്നത് പ്രോട്ടീന്റെ പോളിക്കേഷനുകളുമായുള്ള പ്രതിപ്രവർത്തനത്തെ പ്രതിഫലിപ്പിക്കുന്നതിനാൽ, LLPS-ന്റെ അഭാവത്തിൽ വിവിധ പോളിക്കേഷനുകളുമായുള്ള αS-ന്റെ ബന്ധത്തെ വിലയിരുത്തുന്നതിന് ഞങ്ങൾ ഒരു EPR ടൈറ്ററേഷൻ നടത്തി (ശേഖരണം ഇല്ല. ബഫർ LLPS), നേർപ്പിച്ചതും സാന്ദ്രീകൃതവുമായ ഘട്ടങ്ങളിൽ ഇടപെടലുകൾ സമാനമാണെന്ന് നിർദ്ദേശിക്കുന്നു (അത് ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ, സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 4a, അനുബന്ധ ചിത്രം. 6 എന്നിവയാൽ സ്ഥിരീകരിക്കപ്പെടുന്നു).എല്ലാ കോസർവേറ്റുകളും അവയുടെ പൊതുവായ ദ്രാവകം പോലെയുള്ള ഗുണങ്ങൾ ഉണ്ടായിരുന്നിട്ടും, തന്മാത്രാ തലത്തിൽ അടിസ്ഥാനപരമായ എന്തെങ്കിലും വ്യത്യസ്ത സ്വഭാവം പ്രകടിപ്പിക്കുന്നുണ്ടോ എന്ന് നോക്കുകയായിരുന്നു ലക്ഷ്യം.പ്രതീക്ഷിച്ചതുപോലെ, EPR സ്പെക്ട്രം വർദ്ധിച്ചുവരുന്ന പോളിക്കേഷൻ കോൺസൺട്രേഷൻ കൊണ്ട് വികസിച്ചു, എല്ലാ പാരസ്പര്യ പങ്കാളികളുടെയും തന്മാത്രാ ഇടപെടലുകൾ മൂലം തന്മാത്രാ വഴക്കം കുറയുന്നത് പ്രതിഫലിപ്പിക്കുന്നു (ചിത്രം. 3e, അനുബന്ധ ചിത്രം. 6).ΔNt-Tau, Tau441 എന്നിവയുമായി താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ കുറഞ്ഞ മോളാർ അനുപാതത്തിലാണ് pLK ഈ സാച്ചുറേഷൻ നേടിയത് (പോളിക്കേഷൻ:αS).വാസ്തവത്തിൽ, n സമാനവും സ്വതന്ത്രവുമായ ബൈൻഡിംഗ് സൈറ്റുകൾ അനുമാനിക്കുന്ന ഒരു ഏകദേശ ബൈൻഡിംഗ് മോഡലുമായി ഡാറ്റ താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ, pLK (~5 μM) ന്റെ വ്യക്തമായ വിഘടിത സ്ഥിരാങ്കം Tau441 അല്ലെങ്കിൽ ΔNt-Tau (~50 μM) എന്നതിനേക്കാൾ കുറഞ്ഞ അളവിലുള്ള ഒരു ക്രമമാണ്. ).µM).ഇതൊരു ഏകദേശ കണക്ക് ആണെങ്കിലും, തുടർച്ചയായ പോസിറ്റീവ് ചാർജ്ജ് മേഖലകളുള്ള ലളിതമായ പോളിക്കേഷനുകളോട് αS ന് ഉയർന്ന അടുപ്പമുണ്ടെന്ന് ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.αS ഉം വിവിധ പോളിക്കേഷനുകളും തമ്മിലുള്ള ബന്ധത്തിലെ ഈ വ്യത്യാസം കണക്കിലെടുത്ത്, അവയുടെ ദ്രാവക ഗുണങ്ങൾ കാലക്രമേണ വ്യത്യസ്തമായി മാറാമെന്നും അങ്ങനെ വ്യത്യസ്ത LSPT പ്രക്രിയകളാൽ ബാധിക്കപ്പെടുമെന്നും ഞങ്ങൾ അനുമാനിക്കുന്നു.
പ്രോട്ടീൻ കോസർവേറ്റിനുള്ളിലെ വളരെ തിരക്കേറിയ അന്തരീക്ഷവും പ്രോട്ടീന്റെ അമിലോയിഡ് സ്വഭാവവും കണക്കിലെടുത്ത്, സാധ്യമായ എൽഎസ്പിടി പ്രക്രിയകൾ കണ്ടെത്തുന്നതിന് കാലക്രമേണ കോസർവേറ്റിന്റെ സ്വഭാവം ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു.BF, CF മൈക്രോസ്‌കോപ്പി (ചിത്രം 4) ഉപയോഗിച്ച്, αS/Tau441 ലായനിയിൽ വലിയൊരു പരിധിവരെ കോസർവേറ്റുചെയ്യുന്നത് ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു, പ്രതീക്ഷിച്ചതുപോലെ, കിണറിന്റെ/സ്ലൈഡിന്റെ അടിഭാഗത്തുള്ള ഉപരിതലത്തെ പൂർണ്ണമായ തുള്ളികളായി സമ്പർക്കം പുലർത്തുകയും നനയ്ക്കുകയും ചെയ്യുന്ന വലിയ തുള്ളികൾ ഉണ്ടാക്കുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 7d);താഴെയുള്ള ഈ ഘടനകളെ നമ്മൾ "പ്രോട്ടീൻ റാഫ്റ്റുകൾ" എന്ന് വിളിക്കുന്നു.ഫ്യൂസ് ചെയ്യാനുള്ള കഴിവ് നിലനിർത്തിയതിനാൽ ഈ ഘടനകൾ ദ്രാവകമായി തുടർന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 7 ബി) എൽഎൽപിഎസ് പ്രവർത്തനക്ഷമമായതിന് ശേഷം മണിക്കൂറുകളോളം കാണാനാകും (ചിത്രം. 4, അനുബന്ധ ചിത്രം. 7c).അസന്തുലിതമായ ചാർജുകളും അതുവഴി ഉയർന്ന ഇലക്ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് ഉപരിതല സാധ്യതകളുമുള്ള ഇലക്ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് കോസർവേറ്റുകൾക്ക് പ്രതീക്ഷിക്കുന്നത് പോലെ, നനവ് പ്രക്രിയ ഹൈഡ്രോഫോബിക് മെറ്റീരിയലുകളേക്കാൾ (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 7 എ) ഹൈഡ്രോഫിലിക് ഉപരിതലത്തിൽ അനുകൂലമാണെന്ന് ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു.ശ്രദ്ധേയമായി, αS/ΔNt-Tau കോലസെൻസും റാഫ്റ്റിംഗും ഗണ്യമായി കുറഞ്ഞു, അതേസമയം αS/pLK കണ്ടൻസേറ്റുകൾ ഗണ്യമായി കുറഞ്ഞു (ചിത്രം 4).ചെറിയ ഇൻകുബേഷൻ സമയത്ത്, αS/pLK തുള്ളികൾ സംയോജിപ്പിച്ച് ഹൈഡ്രോഫിലിക് ഉപരിതലത്തെ നനയ്ക്കാൻ കഴിഞ്ഞു, എന്നാൽ ഈ പ്രക്രിയ പെട്ടെന്ന് നിർത്തി, 5 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേഷനുശേഷം, പരിമിതമായ സംയോജന സംഭവങ്ങൾ മാത്രമേ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടിട്ടുള്ളൂ, നനവുണ്ടായില്ല.- ജെൽ-ഡ്രിപ്പ് ട്രാൻസിഷൻ.
100 µM αS (1% ഫ്ലൂറസന്റ് ലേബൽ) അടങ്ങിയ കോസർവേറ്റ് സാമ്പിളുകളുടെ പ്രതിനിധി BF (ഗ്രേസ്‌കെയിൽ പാനലുകൾ), CF (വലത് പാനലുകൾ, AF488-ലേബൽ αS പച്ച നിറത്തിൽ) എന്നിവ 100 µM ന്റെ സാന്നിധ്യത്തിൽ LLPS ബഫറിൽ 100 ​​µM Taufluoresct picstop (ചിത്രംΔ441sctop) -ടൗ (മധ്യഭാഗം) അല്ലെങ്കിൽ 1 mM pLK (താഴെ) വിവിധ ഇൻകുബേഷൻ സമയങ്ങളിലും ഫോക്കൽ ഉയരങ്ങളിലും (z, പ്ലേറ്റിന്റെ അടിയിൽ നിന്നുള്ള ദൂരം നന്നായി).ഒരേ ഫലങ്ങളോടെ പരീക്ഷണങ്ങൾ പരസ്പരം സ്വതന്ത്രമായി 4-6 തവണ ആവർത്തിച്ചു.αS/Tau441 കോസർവേറ്റുകൾ 24 മണിക്കൂറിന് ശേഷം നനഞ്ഞ് ചിത്രത്തേക്കാൾ വലിയ ചങ്ങാടങ്ങൾ ഉണ്ടാക്കുന്നു.എല്ലാ ചിത്രങ്ങളുടെയും സ്കെയിൽ ബാർ 20 µm ആണ്.
αS/Tau441 LLPS-ൽ രൂപം കൊള്ളുന്ന വലിയ ദ്രാവകം പോലുള്ള പ്രോട്ടീൻ പൂളുകൾ പഠിച്ച ഏതെങ്കിലും പ്രോട്ടീനുകളുടെ അമിലോയിഡ് അഗ്രഗേഷനിലേക്ക് നയിക്കുമോ എന്ന് ഞങ്ങൾ അപ്പോൾ ചോദിച്ചു.മേൽപ്പറഞ്ഞ അതേ വ്യവസ്ഥകളിൽ WF മൈക്രോസ്കോപ്പി ഉപയോഗിച്ച് കാലക്രമേണ αS/Tau441 തുള്ളികളുടെ പക്വത ഞങ്ങൾ പിന്തുടർന്നു, എന്നാൽ 1 μM AF488-ലേബൽ ചെയ്ത αS, Atto647N-ലേബൽ ചെയ്ത Tau441 (ചിത്രം 5a) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ചു.പ്രതീക്ഷിച്ചതുപോലെ, പക്വത പ്രക്രിയയിലുടനീളം ഞങ്ങൾ പൂർണ്ണമായ പ്രോട്ടീൻ പ്രാദേശികവൽക്കരണം നിരീക്ഷിച്ചു.രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, ഏകദേശം.5 മണിക്കൂറിന് ശേഷം, റാഫ്റ്റുകൾക്കുള്ളിൽ കൂടുതൽ തീവ്രമായ നോൺ-വൃത്താകൃതിയിലുള്ള ഘടനകൾ നിരീക്ഷിച്ചു, അവയെ ഞങ്ങൾ "പോയിന്റ്" എന്ന് വിളിച്ചു, അവയിൽ ചിലത് αS ഉപയോഗിച്ച് കോലോക്കലൈസ് ചെയ്തു, ചിലത് Tau441 ൽ സമ്പുഷ്ടമാക്കി (ചിത്രം 5a, വെളുത്ത അമ്പടയാളങ്ങൾ).αS/ΔNt-Tau-നേക്കാൾ αS/ΔNt-Tau-നേക്കാൾ വലിയ അളവിൽ റാഫ്റ്റുകൾക്കുള്ളിൽ ഈ പാടുകൾ എപ്പോഴും നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്.pLK, Tau എന്നീ സിസ്റ്റങ്ങളുടെ തുള്ളികൾ ഫ്യൂഷൻ/നനയ്ക്കാൻ കഴിവില്ലാത്ത വ്യതിരിക്തമായ പാടുകൾ ഇല്ലായിരുന്നു.αS ഉം Tau441 ഉം അടങ്ങിയ ഈ പാടുകൾ അമിലോയിഡ് പോലെയുള്ള അഗ്രഗേറ്റുകളാണോ എന്ന് പരിശോധിക്കാൻ, ഞങ്ങൾ CF മൈക്രോസ്കോപ്പി ഉപയോഗിച്ച് സമാനമായ ഒരു പരീക്ഷണം നടത്തി, അതിൽ Tau441 Atto647N എന്ന് ലേബൽ ചെയ്യുകയും 12.5 μM അമിലോയിഡ്-നിർദ്ദിഷ്ട തയോഫ്ലേവിൻ-T (ThT) തുടക്കം മുതൽ ചേർക്കുകയും ചെയ്തു.ചായം.24 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേഷനു ശേഷവും αS/Tau441 തുള്ളികളുടെയോ ചങ്ങാടങ്ങളുടെയോ ThT-കളങ്കം നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടില്ലെങ്കിലും (ചിത്രം. 5b, മുകളിലെ നിര - പ്രോട്ടീൻ റാഫ്റ്റുകൾക്ക് മുകളിൽ ശേഷിക്കുന്ന തുള്ളികൾ), ചങ്ങാടത്തിനുള്ളിൽ Atto647N-Tau441 അടങ്ങിയ ThT- പോസിറ്റീവ് ഘടനകൾ വളരെ ദുർബലമായിരുന്നു.ഇത് മുമ്പ് വിവരിച്ച പാടുകളുടെ വലിപ്പം, ആകൃതി, സ്ഥാനം എന്നിവ ആവർത്തിക്കുന്നു (ചിത്രം 5 ബി, മധ്യഭാഗവും താഴെയും വരികൾ), പ്രായമാകുന്ന ദ്രാവക കോസർവേറ്റുകളിൽ രൂപം കൊള്ളുന്ന അമിലോയിഡ് പോലെയുള്ള അഗ്രഗേറ്റുകളുമായി പാടുകൾ പൊരുത്തപ്പെടാമെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
LLPS ബഫർ പ്ലേറ്റിന്റെ കിണറ്റിൽ 25 μM Tau441 (1 μM AF488-ലേബൽ ചെയ്‌ത αS, Atto647N-ലേബൽ ചെയ്‌ത Tau441) സാന്നിധ്യത്തിൽ വിവിധ ഇൻകുബേഷൻ സമയങ്ങളിലും ഫോക്കൽ ഉയരങ്ങളിലും (z, അൺബൗണ്ട് അടിയിൽ നിന്നുള്ള ദൂരം) WF 25 μM αS. .സമാനമായ ഫലങ്ങളോടെ ആറ് പരീക്ഷണങ്ങൾ സ്വതന്ത്രമായി ആവർത്തിച്ചു.b 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-ലേബൽ ചെയ്ത Tau441), 12.5 μM thioflavin-T (ThT) എന്നിവയുടെ സാന്നിധ്യത്തിൽ 25 μM αS-ന്റെ CF മൈക്രോസ്കോപ്പിക് ചിത്രം.വെയ്റ്റഡ് പ്രോട്ടീൻ തുള്ളികളും നിക്ഷേപിച്ച പ്രോട്ടീൻ റാഫ്റ്റുകളും പാടുകളും യഥാക്രമം മുകളിലെയും മധ്യത്തിലെയും വരികളിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.താഴത്തെ വരി 3 സ്വതന്ത്ര പകർപ്പുകളിൽ നിന്നുള്ള റാഫ്റ്റുകളുടെയും ഡ്രോപ്പുകളുടെയും ചിത്രങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു.വെളുത്ത അമ്പടയാളങ്ങൾ രണ്ട് പാനലുകളിലും ThT പോസിറ്റീവ് ഡോട്ടുകൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.എല്ലാ ചിത്രങ്ങളുടെയും സ്കെയിൽ ബാർ 20 µm ആണ്.
ദ്രാവകത്തിൽ നിന്ന് ഖരാവസ്ഥയിലേക്ക് മാറുന്ന സമയത്ത് കോസർവേറ്റ് പ്രോട്ടീൻ ശൃംഖലയിലെ മാറ്റങ്ങൾ കൂടുതൽ വിശദമായി പരിശോധിക്കാൻ, ഞങ്ങൾ ഫ്ലൂറസെൻസ് ലൈഫ് ടൈം ഇമേജിംഗും (FLIM) Förster resonance energy transfer microscopy (FRET) ഉപയോഗിച്ചു (ചിത്രം 6, അനുബന്ധ കണക്കുകൾ 8 ഉം 9 ഉം).പാളി കൂടുതൽ ഘനീഭവിച്ചതോ ഖരരൂപത്തിലുള്ളതോ ആയ സംയോജിത പ്രോട്ടീൻ ഘടനയിലേയ്‌ക്കുള്ള കോസർവേറ്റ് പക്വത പ്രോട്ടീനും അതിൽ ഘടിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന ഫ്ലൂറസെന്റ് പ്രോബും തമ്മിലുള്ള അടുത്ത സമ്പർക്കത്തിലേക്ക് നയിക്കുന്നു, ഇത് ഹ്രസ്വമായ ഒരു പ്രോബ് ആയുസ്സിൽ (τ) പ്രകടമാകുന്ന ഒരു ശമിപ്പിക്കുന്ന പ്രഭാവം ഉണ്ടാക്കാൻ സാധ്യതയുണ്ടെന്ന് ഞങ്ങൾ അനുമാനിക്കുന്നു. , മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ40.,41,42.കൂടാതെ, ഇരട്ട ലേബൽ ചെയ്‌ത സാമ്പിളുകൾക്ക് (യഥാക്രമം FRET ദാതാവായും സ്വീകാര്യമായ ചായങ്ങളായും AF488, Atto647N), τ-യിലെ ഈ കുറവ് കോസർവേറ്റ് കണ്ടൻസേഷനും LSPT സമയത്ത് FRET(E) കാര്യക്ഷമതയിൽ വർദ്ധനവും ഉണ്ടാകാം.ഞങ്ങൾ LLPS αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau സാമ്പിളുകളിൽ കാലക്രമേണ റാഫ്റ്റും സ്പോട്ട് രൂപീകരണവും നിരീക്ഷിച്ചു (എൽഎൽപിഎസ് ബഫറിലെ ഓരോ പ്രോട്ടീനിന്റെയും 25 µM 1 µM AF488 അടങ്ങുന്ന αS കൂടാതെ/അല്ലെങ്കിൽ Tau447N ലേബൽ ചെയ്ത Tau447N ലേബൽ ചെയ്ത Tau447N).AF488 (τ488), Atto647N (τ647N) പ്രോബുകളുടെ ഫ്ലൂറസെൻസ് ആയുസ്സ്, കോസർവേറ്റുകൾ പക്വത പ്രാപിക്കുമ്പോൾ (ചിത്രം 6, സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 8c) എന്നിവയിൽ ഒരു പൊതു പ്രവണത ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു.രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, റാഫ്റ്റിനുള്ളിലെ ഡോട്ടുകൾക്ക് ഈ മാറ്റം ഗണ്യമായി വർദ്ധിപ്പിച്ചു (ചിത്രം. 6c), ഡോട്ടുകളിൽ കൂടുതൽ പ്രോട്ടീൻ ഘനീഭവിക്കുന്നത് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.ഇതിനെ പിന്തുണച്ചുകൊണ്ട്, 24 മണിക്കൂർ പ്രായമുള്ള αS/ΔNt-Tau തുള്ളികൾക്ക് ഫ്ലൂറസെൻസ് ആയുസ്സിൽ കാര്യമായ മാറ്റമൊന്നും കണ്ടില്ല (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 8d), ഡ്രോപ്ലെറ്റ് ജീലേഷൻ എന്നത് സ്പോട്ടിംഗിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്‌തമായ ഒരു പ്രക്രിയയാണെന്നും അത് കാര്യമായ തന്മാത്രാ പുനഃസംഘടനയോടൊപ്പം ഇല്ലെന്നും സൂചിപ്പിക്കുന്നു. കോസർവേറ്റിനുള്ളിൽ.പ്രത്യേകിച്ചു αS/Tau441 സിസ്റ്റത്തിന് (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 8e) αS-ൽ ഡോട്ടുകൾക്ക് വ്യത്യസ്ത വലുപ്പങ്ങളും വേരിയബിൾ ഉള്ളടക്കവും ഉണ്ടെന്ന് ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്.സ്പോട്ട് ഫ്ലൂറസെൻസ് ആയുസ്സ് കുറയുന്നത് തീവ്രതയിൽ വർദ്ധനവുണ്ടായി, പ്രത്യേകിച്ച് Atto647N എന്ന് ലേബൽ ചെയ്ത Tau441 (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 8a), കൂടാതെ αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau എന്നീ രണ്ട് സിസ്റ്റങ്ങൾക്ക് ഉയർന്ന FRET കാര്യക്ഷമതയും, ഇത് കൂടുതൽ ഘനീഭവിക്കുന്ന അഞ്ച് മണിക്കൂറുകളെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ട്രിഗർ ചെയ്ത ശേഷം, സ്റ്റാറ്റിക് വൈദ്യുതിക്കുള്ളിലെ പ്രോട്ടീനുകൾ ഘനീഭവിച്ചു.αS/ΔNt-Tau-മായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, αS/Tau441 സ്പോട്ടുകളിൽ താഴ്ന്ന τ647N ഉം അൽപ്പം കൂടിയ τ488 മൂല്യങ്ങളും ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു, ഒപ്പം താഴ്ന്നതും കൂടുതൽ അസമമായ FRET മൂല്യങ്ങളും.ഒരുപക്ഷേ, ഇത് αS/Tau441 സിസ്റ്റത്തിൽ, അഗ്രഗേറ്റുകളിൽ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടതും പ്രതീക്ഷിക്കപ്പെടുന്നതുമായ αS സമൃദ്ധി കൂടുതൽ വൈവിധ്യപൂർണ്ണമാണ്, പലപ്പോഴും Tau- നെ അപേക്ഷിച്ച് സബ്‌സ്റ്റോയ്കിയോമെട്രിക് ആണ്, കാരണം Tau441 തന്നെ LLPS-നും അഗ്രഗേഷനും വിധേയമായേക്കാം (സപ്ലിമെന്ററി) ചിത്രം. .എന്നിരുന്നാലും, Tau441-ഉം αS-ഉം ഉള്ളപ്പോൾ, ഡ്രോപ്ലെറ്റ് കോലസെൻസ്, റാഫ്റ്റ് രൂപീകരണം, പ്രധാനമായി, ദ്രാവകം പോലെയുള്ള കോസർവേറ്റുകൾക്കുള്ളിലെ പ്രോട്ടീൻ അഗ്രഗേഷൻ എന്നിവയുടെ അളവ് പരമാവധി ആയിരിക്കും.
ഓരോ പ്രോട്ടീനിന്റെയും 25 μM-ൽ αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau എന്നിവയുടെ ലൈഫ് ടൈം ഫ്ലൂറസെൻസ് മൈക്രോസ്‌കോപ്പി (FLIM) ചിത്രങ്ങൾ (1 μM AF488-ലേബൽ ചെയ്ത αS, 1 μM Atto647N-ലേബൽ ചെയ്‌ത Tau441 അല്ലെങ്കിൽ ΔNLL-TauPS-ൽ.നിരകൾ വ്യത്യസ്ത പക്വത സമയങ്ങളിൽ (30 മിനിറ്റ്, 5 മണിക്കൂർ, 24 മണിക്കൂർ) LLPS സാമ്പിളുകളുടെ പ്രതിനിധി ചിത്രങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു.ചുവന്ന ഫ്രെയിം αS/Tau441 പാടുകൾ അടങ്ങിയ പ്രദേശം കാണിക്കുന്നു.ലൈഫ് സ്പാൻ കളർ ബാറുകളായി കാണിക്കുന്നു.എല്ലാ ചിത്രങ്ങൾക്കും സ്കെയിൽ ബാർ = 20 µm.b പാനലിലെ ചുവന്ന ബോക്സിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്ന തിരഞ്ഞെടുത്ത ഏരിയയുടെ FLIM ഇമേജ് സൂം ഇൻ ചെയ്‌തു.എ പാനലിലെ അതേ വർണ്ണ സ്കെയിൽ ഉപയോഗിച്ചാണ് ലൈഫ് ശ്രേണികൾ കാണിക്കുന്നത്.സ്കെയിൽ ബാർ = 5 µm.c AF488 (αS-ലേക്ക് ഘടിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു) അല്ലെങ്കിൽ Atto647N (Tau- യിൽ ഘടിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു) കാണിക്കുന്ന വിവിധ പ്രോട്ടീൻ സ്പീഷീസുകൾ (ഡ്രോപ്ലെറ്റുകൾ-D-, റാഫ്റ്റ്-R-, സ്പെക്കിൾ-P) എന്നിവ αS- നായി രേഖപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്ന FLIM ചിത്രങ്ങളിൽ തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുണ്ട്. αS/ΔNt-Tau coacervate സാമ്പിളുകൾ (D-യ്‌ക്ക് N = 17-32 ROI, R-ന് 29-44 ROI, പോയിന്റുകൾക്ക് 21-51 ROI).ബോക്സുകൾക്കുള്ളിൽ യഥാക്രമം മഞ്ഞ ചതുരങ്ങളായും കറുത്ത വരകളായും ശരാശരി, മീഡിയൻ മൂല്യങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു.ബോക്‌സിന്റെ താഴത്തെയും മുകളിലെയും അതിരുകൾ യഥാക്രമം ഒന്നും മൂന്നും ക്വാർട്ടൈലുകളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു, കൂടാതെ 1.5 മടങ്ങ് ഇന്റർക്വാർട്ടൈൽ ശ്രേണിയിലെ (IQR) ഏറ്റവും കുറഞ്ഞതും കൂടിയതുമായ മൂല്യങ്ങൾ വിസ്‌ക്കറായി കാണിക്കുന്നു.ഔട്ട്‌ലറുകൾ കറുത്ത വജ്രങ്ങളായി കാണിക്കുന്നു.ജോഡി ഡിസ്ട്രിബ്യൂഷനുകൾ തമ്മിലുള്ള സ്ഥിതിവിവരക്കണക്ക് പ്രാധാന്യം രണ്ട്-സാമ്പിൾ ടി-ടെസ്റ്റ് ഉപയോഗിച്ച് നിർണ്ണയിക്കപ്പെട്ടു, അസമമായ വ്യതിയാനങ്ങൾ അനുമാനിക്കുന്നു.താരതമ്യപ്പെടുത്തിയ ഓരോ ജോഡി ഡാറ്റയ്ക്കും രണ്ട്-വാലുള്ള ടി-ടെസ്റ്റ് പി-മൂല്യങ്ങൾ നക്ഷത്രചിഹ്നങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച് കാണിക്കുന്നു (* p-മൂല്യം > 0.01, ** p-മൂല്യം > 0.001, *** p-മൂല്യം > 0.0001, **** p-value > 0.00001), ns നിസ്സാരതയെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു (p-മൂല്യം > 0.05).കൃത്യമായ പി മൂല്യങ്ങൾ സപ്ലിമെന്ററി ടേബിൾ 1 ൽ നൽകിയിരിക്കുന്നു, കൂടാതെ യഥാർത്ഥ ഡാറ്റ റോ ഡാറ്റ ഫയലുകളായി അവതരിപ്പിക്കുന്നു.
സ്‌പെക്കിളുകളുടെ/അഗ്രഗേറ്റുകളുടെ അമിലോയിഡ് പോലെയുള്ള സ്വഭാവം കൂടുതൽ തെളിയിക്കാൻ, ഞങ്ങൾ 24 മണിക്കൂർ (1 M) NaCl ന്റെ ഉയർന്ന സാന്ദ്രത ഉപയോഗിച്ച് അൺസ്റ്റെയിൻഡ് കോസർവേറ്റ് സാമ്പിളുകൾ ചികിത്സിച്ചു, ഇത് പ്രോട്ടീൻ കോസർവേറ്റുകളിൽ നിന്ന് അഗ്രഗേറ്റുകളെ വേർതിരിക്കുന്നതിന് കാരണമായി.അറ്റോമിക് ഫോഴ്‌സ് മൈക്രോസ്‌കോപ്പി (AFM) ഉപയോഗിച്ച് ഒറ്റപ്പെട്ട അഗ്രഗേറ്റുകൾ (അതായത്, അഗ്രഗേറ്റുകളുടെ ചിതറിക്കിടക്കുന്ന പരിഹാരം) നിരീക്ഷിച്ചപ്പോൾ, ഏകദേശം 15 nm ന്റെ സാധാരണ ഉയരമുള്ള ഒരു പ്രധാന ഗോളാകൃതിയിലുള്ള രൂപഘടന ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു, ഇത് ഉയർന്ന ഉപ്പ് സാന്ദ്രതയുടെ അവസ്ഥയിൽ സഹവസിക്കുന്ന പ്രവണത കാണിക്കുന്നു. ഉപരിതലത്തിൽ ശക്തമായ ഹൈഡ്രോഫോബിക് പ്രഭാവം കാരണം സാധാരണ അമിലോയിഡ് ഫൈബ്രിലുകളുടെ സ്വഭാവം (ഫൈബ്രിലുകൾക്ക് സാധാരണയായി ~10 nm ഉയരം ഉണ്ടെന്ന് ശ്രദ്ധിക്കുക) (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 10a).രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, ഒരു സാധാരണ ThT ഫ്ലൂറസെൻസ് അസെയിൽ ഒറ്റപ്പെട്ട അഗ്രഗേറ്റുകൾ ThT ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തപ്പോൾ, ThT ഫ്ലൂറസെൻസ് ക്വാണ്ടം വിളവിൽ ഒരു നാടകീയമായ വർദ്ധനവ് ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു, സാധാരണ αS അമിലോയിഡ് ഫൈബ്രിലുകൾ (സപ്ലിമെന്ററി) ഉപയോഗിച്ച് ഡൈ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുമ്പോൾ നിരീക്ഷിച്ചതുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്താവുന്നതാണ് (ചിത്രം 10b). കോസർവേറ്റ് അഗ്രഗേറ്റുകളിൽ അമിലോയിഡ് പോലുള്ള ഘടനകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു..വാസ്തവത്തിൽ, അഗ്രഗേറ്റുകൾ ഉയർന്ന ഉപ്പ് സാന്ദ്രതയോട് സഹിഷ്ണുത പുലർത്തുന്നവയാണ്, എന്നാൽ സാധാരണ അമിലോയിഡ് ഫൈബ്രിലുകൾ പോലെ (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 10c) 4 M ഗ്വാനിഡിൻ ക്ലോറൈഡിന് (GdnHCl) സെൻസിറ്റീവ് ആയിരുന്നു.
അടുത്തതായി, സിംഗിൾ മോളിക്യൂൾ ഫ്ലൂറസെൻസ്, സ്പെസിഫിക് ഫ്ലൂറസെൻസ് കോറിലേഷൻ/ക്രോസ് കോറിലേഷൻ സ്പെക്ട്രോസ്കോപ്പി (എഫ്സിഎസ്/എഫ്സിസിഎസ്), ടു-കളർ കോയിൻസിഡൻസ് ഡിറ്റക്ഷന്റെ ബർസ്റ്റ് അനാലിസിസ് (ടിസിസിഡി) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് ഞങ്ങൾ അഗ്രഗേറ്റുകളുടെ ഘടന വിശകലനം ചെയ്തു.ഇതിനായി, αS, Tau441 (രണ്ടും 25 μM) അടങ്ങിയ 100 μl LLPS സാമ്പിളുകളിൽ 1 μM AF488-ലേബൽ ചെയ്‌ത αS, 1 μM Atto647N-ലേബൽ ചെയ്‌ത Tau441 എന്നിവയ്‌ക്കൊപ്പം 24 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേഷനുശേഷം രൂപംകൊണ്ട അഗ്രഗേറ്റുകളെ ഞങ്ങൾ വേർതിരിച്ചു.എൽ‌എൽ‌പി‌എസും പ്രോട്ടീനും തമ്മിലുള്ള സാധ്യമായ ഇലക്‌ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് ഇടപെടലുകൾ തടയുന്നതിന്, അതേ PEG-ഫ്രീ ബഫറും 1 M NaCl (കോസർ‌വേറ്റിൽ നിന്ന് അഗ്രഗേറ്റുകളെ വേർതിരിക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന അതേ ബഫർ) ഉപയോഗിച്ച് ഫലമായുണ്ടാകുന്ന ചിതറിക്കിടക്കുന്ന മൊത്തത്തിലുള്ള ലായനി ഒരു മോണോമോളിക്യുലാർ അവസ്ഥയിലേക്ക് നേർപ്പിക്കുക.ഒരൊറ്റ തന്മാത്രയുടെ സമയപഥത്തിന്റെ ഒരു ഉദാഹരണം ചിത്രം 7a-ൽ കാണാം.FCCS/FCS വിശകലനം (ക്രോസ്-കോറിലേഷൻ, CC, autocorrelation, AC) സാമ്പിളുകളിൽ αS ഉം tau ഉം അടങ്ങിയ അഗ്രഗേറ്റുകൾ ധാരാളമുണ്ടെന്ന് കാണിക്കുന്നു (ചിത്രം 7b ലെ CC കർവ് കാണുക, ഇടത് പാനൽ) നേർപ്പിക്കൽ പ്രക്രിയയുടെ ഫലം (ചിത്രം 7b, ഇടത് പാനലിലെ AC കർവുകൾ കാണുക).മോണോമെറിക് പ്രോട്ടീനുകൾ മാത്രം അടങ്ങിയ സാമ്പിളുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ഇതേ സൊല്യൂഷൻ അവസ്ഥകളിൽ നടത്തിയ നിയന്ത്രണ പരീക്ഷണങ്ങൾ CC കർവുകളൊന്നും കാണിച്ചില്ല, കൂടാതെ മോണോമെറിക് പ്രോട്ടീനുകൾക്ക് പ്രതീക്ഷിക്കുന്ന ഡിഫ്യൂഷൻ കോഫിഫിഷ്യന്റുകളുള്ള ഏക-ഘടക ഡിഫ്യൂഷൻ മോഡലുമായി (Eq. 4) എസി കർവുകൾ നന്നായി യോജിക്കുന്നു (ചിത്രം 7 ബി. ), വലത് പാനൽ).സമാഹരിച്ച കണങ്ങളുടെ വ്യാപന ഗുണകം 1 µm2/s-ൽ താഴെയാണ്, മോണോമെറിക് പ്രോട്ടീനുകളുടേത് ഏകദേശം 1 µm2/s ആണ്.50-100 µm/s;സോണിക്കേറ്റഡ് αS അമിലോയിഡ് ഫൈബ്രിലുകൾക്കും മോണോമെറിക് αS നും സമാനമായ പരിഹാര സാഹചര്യങ്ങളിൽ വെവ്വേറെ മുമ്പ് പ്രസിദ്ധീകരിച്ച മൂല്യങ്ങൾക്ക് സമാനമാണ് മൂല്യങ്ങൾ44.TCCD സ്ഫോടന വിശകലനം (ചിത്രം 7c, മുകളിലെ പാനൽ) ഉപയോഗിച്ച് ഞങ്ങൾ അഗ്രഗേറ്റുകൾ വിശകലനം ചെയ്തപ്പോൾ, ഓരോ ഒറ്റപ്പെട്ട അഗ്രഗേറ്റിലും (αS/Tau heteroaggregate), ഏകദേശം 60% കണ്ടെത്തിയ അഗ്രഗേറ്റുകളിൽ αS ഉം tau ഉം അടങ്ങിയിട്ടുണ്ട്, ഏകദേശം 30% മാത്രമേ അടങ്ങിയിട്ടുള്ളൂ. tau, ഏകദേശം 10% αS മാത്രം.αS/Tau heteroaggregates-ന്റെ Stoichiometric വിശകലനം കാണിക്കുന്നത് ഭൂരിഭാഗം heteroaggregates-ഉം tau-ൽ സമ്പുഷ്ടമാണ് (Stoichiometry 0.5-ൽ താഴെയാണ്, മൊത്തം ഓരോ tau തന്മാത്രകളുടെ ശരാശരി എണ്ണം αS തന്മാത്രകളേക്കാൾ 4 മടങ്ങ് കൂടുതലാണ്), ഇത് FLIM-ൽ ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ച പ്രവർത്തനവുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു. പരീക്ഷണങ്ങൾ..ഈ അഗ്രഗേറ്റുകളിൽ രണ്ട് പ്രോട്ടീനുകളും അടങ്ങിയിട്ടുണ്ടെന്ന് FRET വിശകലനം കാണിക്കുന്നു, എന്നിരുന്നാലും ഈ കേസിൽ യഥാർത്ഥ FRET മൂല്യങ്ങൾക്ക് വലിയ പ്രാധാന്യമില്ല, കാരണം പരീക്ഷണത്തിൽ ഉപയോഗിച്ച ലേബൽ ചെയ്യാത്ത പ്രോട്ടീന്റെ അധികമായതിനാൽ ഓരോ അഗ്രഗേറ്റിലും ഫ്ലൂറോഫോറുകളുടെ വിതരണം ക്രമരഹിതമായിരുന്നു.കൗതുകകരമെന്നു പറയട്ടെ, 45,46 മുതിർന്ന അമിലോയിഡ് അഗ്രഗേഷൻ-ഡിഫിഷ്യന്റ് ടൗ വേരിയന്റ് ഉപയോഗിച്ച് ഞങ്ങൾ അതേ വിശകലനം നടത്തിയപ്പോൾ (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 11a,b കാണുക), αS ഇലക്‌ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് അഗ്രഗേഷൻ ഒന്നുതന്നെയാണെങ്കിലും (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 11c, d) കോസർവേറ്റിനുള്ളിൽ അഗ്രഗേറ്റുകൾ രൂപപ്പെടുത്താനുള്ള കഴിവ് ഗണ്യമായി കുറയുകയും, സിറ്റു പരീക്ഷണങ്ങളിൽ FLIM നിരവധി പാടുകൾ കണ്ടെത്തുകയും, ഒറ്റപ്പെട്ട മൊത്തം സാമ്പിളുകൾക്ക് ദുർബലമായ ക്രോസ് കോറിലേഷൻ കർവുകൾ നിരീക്ഷിക്കുകയും ചെയ്തു.എന്നിരുന്നാലും, കണ്ടെത്തിയ അഗ്രഗേറ്റുകളുടെ ഒരു ചെറിയ എണ്ണം (Tau441 ന്റെ പത്തിലൊന്ന് മാത്രം), ഓരോ അഗ്രഗേറ്റും ഈ Tau വേരിയന്റിനേക്കാൾ αS-ൽ സമ്പുഷ്ടമാക്കിയതായി ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു, ഏകദേശം 50% കണ്ടെത്തിയ അഗ്രഗേറ്റുകളിൽ αS തന്മാത്രകൾ മാത്രമേ അടങ്ങിയിട്ടുള്ളൂ, കൂടാതെ αS അധികമായി വ്യത്യസ്തമാണ്. .അഗ്രഗേറ്റുകൾ (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 11e കാണുക), Tau441 (ചിത്രം 6f) സൃഷ്ടിച്ച വൈവിധ്യമാർന്ന അഗ്രഗേറ്റുകളിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമായി.ഈ പരീക്ഷണങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ കാണിക്കുന്നത്, αS-ന് തന്നെ കോസർവേറ്റിനുള്ളിൽ ടൗവിനൊപ്പം അടിഞ്ഞുകൂടാൻ കഴിയുമെങ്കിലും, ഈ സാഹചര്യങ്ങളിൽ ടൗ ന്യൂക്ലിയേഷൻ കൂടുതൽ അനുകൂലമാണെന്നും, ഫലമായുണ്ടാകുന്ന അമിലോയിഡ് പോലെയുള്ള അഗ്രഗേറ്റുകൾക്ക് αS, ടൗ എന്നിവയുടെ രൂപമായി പ്രവർത്തിക്കാൻ കഴിയുമെന്നും കാണിച്ചു.എന്നിരുന്നാലും, ഒരു ടൗ-റിച്ച് കോർ രൂപപ്പെട്ടുകഴിഞ്ഞാൽ, ടൗ തന്മാത്രകൾ തമ്മിലുള്ള ഹോമോടൈപിക് ഇടപെടലുകളേക്കാൾ αS ഉം tau ഉം തമ്മിലുള്ള ഹെറ്ററോടൈപിക് ഇടപെടലുകൾക്ക് അനുകൂലമാണ്;ദ്രാവക αS/tau കോസർവേറ്റുകളിലെ പ്രോട്ടീൻ ശൃംഖലകളും ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിക്കുന്നു.
αS/Tau441 ഇലക്‌ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് കോസർവേറ്റുകളിൽ രൂപപ്പെട്ട ഒറ്റപ്പെട്ട അഗ്രഗേറ്റുകളുടെ ഒറ്റ തന്മാത്രകളുടെ ഒരു പ്രതിനിധി ഫ്ലൂറസെൻസ് ടെമ്പറൽ ട്രെയ്‌സ്.മൂന്ന് ഡിറ്റക്ഷൻ ചാനലുകളിൽ αS/Tau441 കോഗ്രഗേറ്റുകളുമായി ബന്ധപ്പെട്ട പൊട്ടിത്തെറികൾ (സൂചിപ്പിച്ച പരിധിക്ക് മുകളിലുള്ള പൊട്ടിത്തെറികൾ) നിരീക്ഷിച്ചു (AF488, Atto647N നേരിട്ടുള്ള ആവേശത്തിന് ശേഷമുള്ള ഉദ്വമനം, നീലയും ചുവപ്പും വരകൾ, പരോക്ഷ ആവേശത്തിന് ശേഷമുള്ള Atto647N ഉദ്‌വമനം), FRET, വയലറ്റ് ലൈൻ).b LLPS-ൽ നിന്ന് (ഇടത് പാനൽ) ലഭിച്ച ഒറ്റപ്പെട്ട αS/Tau441 അഗ്രഗേറ്റുകളുടെ സാമ്പിളിന്റെ FCS/FCCS വിശകലനം.AF488, Atto647N എന്നിവയ്‌ക്കായുള്ള ഓട്ടോകോറിലേഷൻ (AC) കർവുകൾ യഥാക്രമം നീലയിലും ചുവപ്പിലും കാണിച്ചിരിക്കുന്നു, കൂടാതെ രണ്ട് ഡൈകളും അടങ്ങിയ അഗ്രഗേറ്റുകളുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ക്രോസ് കോറിലേഷൻ (CC) കർവുകൾ പർപ്പിൾ നിറത്തിലും കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.എസി കർവുകൾ ലേബൽ ചെയ്ത മോണോമെറിക്, അഗ്രഗേറ്റഡ് പ്രോട്ടീൻ സ്പീഷീസുകളുടെ സാന്നിധ്യം പ്രതിഫലിപ്പിക്കുന്നു, അതേസമയം സിസി കർവുകൾ ഇരട്ട-ലേബൽ ചെയ്ത അഗ്രഗേറ്റുകളുടെ വ്യാപനം മാത്രമേ കാണിക്കൂ.സമാന വിശകലനം, എന്നാൽ ഒറ്റപ്പെട്ട സ്ഥലങ്ങളിലെ അതേ പരിഹാര സാഹചര്യങ്ങളിൽ, മോണോമെറിക് αS ഉം Tau441 ഉം മാത്രം അടങ്ങിയ സാമ്പിളുകൾ വലത് പാനലിൽ നിയന്ത്രണങ്ങളായി കാണിക്കുന്നു.c αS/Tau441 ഇലക്‌ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് കോസർവേറ്റുകളിൽ രൂപപ്പെട്ട ഒറ്റപ്പെട്ട അഗ്രഗേറ്റുകളുടെ ഒറ്റ തന്മാത്രകളുടെ ഫ്ലൂറസെൻസ് ഫ്ലാഷ് വിശകലനം.നാല് വ്യത്യസ്‌ത ആവർത്തനങ്ങളിൽ (N = 152) കാണുന്ന ഓരോ സംഗ്രഹത്തിന്റെയും വിവരങ്ങൾ അവയുടെ സ്‌റ്റോയ്‌ചിയോമെട്രി, എസ് മൂല്യങ്ങൾ, FRET കാര്യക്ഷമത എന്നിവയ്‌ക്കെതിരെ പ്ലോട്ട് ചെയ്‌തിരിക്കുന്നു (മുകളിൽ പാനൽ, കളർ ബാർ സംഭവത്തെ പ്രതിഫലിപ്പിക്കുന്നു).മൂന്ന് തരം അഗ്രഗേറ്റുകളെ വേർതിരിച്ചറിയാൻ കഴിയും: -αS-ഒൺലി അഗ്രഗേറ്റുകൾ S~1, FRET~0 എന്നിവയും, Tau-ഒൺലി അഗ്രഗേറ്റുകൾ S~0, FRET~1 എന്നിവയും, കൂടാതെ ഇന്റർമീഡിയറ്റ് S ഉള്ള വൈവിധ്യമാർന്ന Tau/αS അഗ്രഗേറ്റുകളും തുകയുടെ FRET എസ്റ്റിമേറ്റുകളും ഓരോ വൈവിധ്യമാർന്ന അഗ്രഗേറ്റിലും (N = 100) കണ്ടെത്തിയ രണ്ട് മാർക്കർ പ്രോട്ടീനുകളും താഴത്തെ പാനലിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു (വർണ്ണ സ്കെയിൽ സംഭവത്തെ പ്രതിഫലിപ്പിക്കുന്നു).റോ ഡാറ്റ ഫയലുകളുടെ രൂപത്തിലാണ് റോ ഡാറ്റ നൽകിയിരിക്കുന്നത്.
ദ്രാവക പ്രോട്ടീന്റെ പക്വത അല്ലെങ്കിൽ വാർദ്ധക്യം, കാലക്രമേണ ജെൽ പോലെയുള്ളതോ ഖരരൂപത്തിലുള്ളതോ ആയ ഘടനകളിലേക്ക് ഘനീഭവിക്കുന്നത്, അമിലോയിഡ് അഗ്രഗേഷൻ 7, 48, 49 ന് മുമ്പുള്ള ഒരു അസാധാരണ പ്രക്രിയയായി കണ്ടൻസേറ്റിന്റെ നിരവധി ശാരീരിക പ്രവർത്തനങ്ങളിലും രോഗങ്ങളിലും ഉൾപ്പെട്ടതായി റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്. ഘട്ടം വേർതിരിക്കുന്നതും പെരുമാറ്റവും ഞങ്ങൾ വിശദമായി പഠിക്കുന്നു.LPS ന്റെ സാധാരണ തെർമോഡൈനാമിക് പ്രേരക സ്വഭാവം പിന്തുടരുന്ന, കുറഞ്ഞ മൈക്രോമോളാർ സാന്ദ്രതയിലും ഫിസിയോളജിക്കൽ പ്രസക്തമായ സാഹചര്യങ്ങളിലും ക്രമരഹിതമായ പോളിക്കേഷനുകളുടെ സാന്നിധ്യത്തിൽ LSPT αS.ഫിസിയോളജിക്കൽ pH-ൽ വളരെ നെഗറ്റീവ് ചാർജുള്ള സി-ടെർമിനൽ മേഖല ഉൾക്കൊള്ളുന്ന αS, ഇലക്ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് പ്രക്രിയയിലൂടെ pLK അല്ലെങ്കിൽ Tau പോലുള്ള ഉയർന്ന കാറ്റാനിക് ഡിസോർഡർ പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ സാന്നിധ്യത്തിൽ LLPS വഴി ജലീയ ലായനിയിൽ പ്രോട്ടീൻ അടങ്ങിയ തുള്ളികൾ രൂപപ്പെടുത്താൻ കഴിയുമെന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി. അഗ്രഗേഷൻ മാക്രോമോളികുലുകളുടെ സാന്നിധ്യത്തിൽ സങ്കീർണ്ണമായ ഘനീഭവിക്കൽ.വിട്രോയിലും vivo51,52,53,54 ലും രോഗവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട അഗ്രഗേഷനുമായി ബന്ധപ്പെട്ട വിവിധ പോളികേഷൻ തന്മാത്രകളെ αS നേരിടുന്ന സെല്ലുലാർ പരിതസ്ഥിതിയിൽ ഈ പ്രക്രിയയ്ക്ക് പ്രസക്തമായ ഫലങ്ങൾ ഉണ്ടായേക്കാം.
പല പഠനങ്ങളിലും, തുള്ളികൾക്കുള്ളിലെ പ്രോട്ടീൻ ഡൈനാമിക്സ് പക്വത പ്രക്രിയയെ നിർണ്ണയിക്കുന്ന പ്രധാന ഘടകങ്ങളിലൊന്നായി കണക്കാക്കപ്പെടുന്നു55,56.ഇലക്‌ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് αS പോളികേഷനുകളുള്ള കോസർവേറ്റുകളിൽ, മെച്യൂറേഷൻ പ്രക്രിയ പ്രത്യക്ഷത്തിൽ പോളികേഷനുകളുമായുള്ള ഇടപെടലുകളുടെ ശക്തി, വാലൻസി, ഈ ഇടപെടലുകളുടെ ഗുണിതം എന്നിവയെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു.രണ്ട് ദ്രവാവസ്ഥകളുടെ സന്തുലിത ഭൂപ്രകൃതി LLPS57,58-നെ നയിക്കുന്ന ബയോപോളിമറുകളാൽ സമ്പന്നമായ ഒരു വലിയ തുള്ളിയുടെ സാന്നിധ്യമാണെന്ന് സന്തുലിത സിദ്ധാന്തം സൂചിപ്പിക്കുന്നു.ചിതറിക്കിടക്കുന്ന ഘട്ടം61-ൽ ഓസ്റ്റ്വാൾഡ് പക്വത, കോലസെൻസ്60 അല്ലെങ്കിൽ ഫ്രീ മോണോമറിന്റെ ഉപഭോഗം എന്നിവയിലൂടെ തുള്ളി വളർച്ച കൈവരിക്കാനാകും.αS, Tau441, ΔNt-Tau അല്ലെങ്കിൽ pLK എന്നിവയ്‌ക്കായി, ഈ പഠനത്തിൽ ഉപയോഗിച്ചിരിക്കുന്ന സാഹചര്യങ്ങളിൽ ഭൂരിഭാഗം പ്രോട്ടീനും കണ്ടൻസേറ്റിൽ കേന്ദ്രീകരിച്ചിരിക്കുന്നു.എന്നിരുന്നാലും, ഉപരിതല നനവിലൂടെ പൂർണ്ണ വലുപ്പത്തിലുള്ള ടൗ തുള്ളികൾ വേഗത്തിൽ കൂടിച്ചേരുമ്പോൾ, ΔNt-Tau, pLK എന്നിവയ്‌ക്ക് തുള്ളികളുടെ സംയോജനവും നനവും ബുദ്ധിമുട്ടായിരുന്നു, ഇത് ഈ രണ്ട് സിസ്റ്റങ്ങളിലെയും ദ്രാവക ഗുണങ്ങളുടെ ദ്രുതഗതിയിലുള്ള നഷ്ടത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.ഞങ്ങളുടെ FLIM-FRET വിശകലനം അനുസരിച്ച്, പ്രായമായ pLK, ΔNt-Tau തുള്ളികൾ യഥാർത്ഥ തുള്ളികൾക്ക് സമാനമായ പ്രോട്ടീൻ അഗ്രഗേഷൻ (സമാനമായ ഫ്ലൂറസെൻസ് ലൈഫ് ടൈം) കാണിച്ചു, യഥാർത്ഥ പ്രോട്ടീൻ ശൃംഖല കൂടുതൽ കർക്കശമാണെങ്കിലും നിലനിർത്തിയെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
ഇനിപ്പറയുന്ന മാതൃകയിൽ ഞങ്ങളുടെ പരീക്ഷണ ഫലങ്ങൾ ഞങ്ങൾ യുക്തിസഹമാക്കുന്നു (ചിത്രം 8).തുടക്കത്തിൽ താൽക്കാലികമായി രൂപപ്പെട്ട തുള്ളികൾ പലപ്പോഴും ഇലക്ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് നഷ്ടപരിഹാരം ഇല്ലാത്ത പ്രോട്ടീൻ നെറ്റ്‌വർക്കുകളാണ്, അതിനാൽ ചാർജ് അസന്തുലിതാവസ്ഥയുടെ മേഖലകളുണ്ട്, പ്രത്യേകിച്ച് ഡ്രോപ്ലെറ്റ് ഇന്റർഫേസിൽ, ഉയർന്ന ഇലക്ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് ഉപരിതല സാധ്യതയുള്ള തുള്ളികൾ ഉണ്ടാകുന്നു.ചാർജിന് (സാധാരണയായി വാലൻസ് ഡിപ്ലിഷൻ എന്ന് വിളിക്കപ്പെടുന്ന ഒരു പ്രതിഭാസം) നഷ്ടപരിഹാരം നൽകുന്നതിനും തുള്ളികളുടെ ഉപരിതല സാധ്യത കുറയ്ക്കുന്നതിനും, തുള്ളികൾ നേർപ്പിച്ച ഘട്ടത്തിൽ നിന്ന് പുതിയ പോളിപെപ്റ്റൈഡുകൾ ഉൾപ്പെടുത്താനും ചാർജ്-ചാർജ് ഇന്ററാക്ഷനുകൾ ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യുന്നതിനായി പ്രോട്ടീൻ നെറ്റ്‌വർക്കുകൾ പുനഃക്രമീകരിക്കാനും മറ്റ് തുള്ളികളുമായി ഇടപഴകാനും കഴിയും.പ്രതലങ്ങളോടെ (നനവ്).αS/pLK തുള്ളികൾ, അവയുടെ ലളിതമായ പ്രോട്ടീൻ നെറ്റ്‌വർക്ക് (αS, pLK എന്നിവയ്‌ക്കിടയിലുള്ള ഹെറ്ററോടൈപ്പിക് ഇടപെടലുകൾ മാത്രം) പ്രോട്ടീൻ-പ്രോട്ടീൻ ഇടപെടലുകളോടുള്ള കൂടുതൽ അടുപ്പവും കാരണം, കണ്ടൻസേറ്റിന്റെ ചാർജ് കൂടുതൽ വേഗത്തിൽ സന്തുലിതമാക്കാൻ കഴിയുമെന്ന് തോന്നുന്നു.യഥാർത്ഥത്തിൽ, αS/Tau-യെ അപേക്ഷിച്ച് തുടക്കത്തിൽ രൂപപ്പെട്ട αS/pLK കോസർവേറ്റുകളിൽ ഞങ്ങൾ വേഗതയേറിയ പ്രോട്ടീൻ ചലനാത്മകത നിരീക്ഷിച്ചു.വാലൻസി ശോഷണത്തിനു ശേഷം, പ്രതിപ്രവർത്തനങ്ങൾ കുറയുകയും, തുള്ളികൾ അവയുടെ ദ്രാവക ഗുണങ്ങൾ നഷ്ടപ്പെടുകയും, കുറഞ്ഞ ഇലക്ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് ഉപരിതല സാധ്യതയുള്ള (അതിനാൽ ഉപരിതലത്തിൽ നനയ്ക്കാൻ കഴിയാതെ) ജെൽ പോലെയുള്ള, തീപിടിക്കാത്ത തുള്ളികൾ ആയി മാറുകയും ചെയ്യുന്നു.നേരെമറിച്ച്, കൂടുതൽ സങ്കീർണ്ണമായ പ്രോട്ടീൻ നെറ്റ്‌വർക്കുകൾ (ഹോമോടൈപിക്, ഹെറ്ററോടൈപ്പിക് ഇന്ററാക്ഷനുകൾക്കൊപ്പം) പ്രോട്ടീൻ ഇടപെടലുകളുടെ ദുർബലമായ സ്വഭാവം എന്നിവ കാരണം ഡ്രോപ്ലെറ്റ് ചാർജ് ബാലൻസ് ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യുന്നതിൽ αS/Tau തുള്ളികൾക്ക് കാര്യക്ഷമത കുറവാണ്.ഇത് ദീർഘകാലത്തേക്ക് ദ്രാവക സ്വഭാവം നിലനിർത്തുകയും ഉയർന്ന ഇലക്ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് ഉപരിതല സാധ്യത പ്രകടിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്ന തുള്ളികൾക്ക് കാരണമാകുന്നു.പ്രോട്ടീൻ ശൃംഖലയിലെ ചാർജ് ഒപ്റ്റിമൈസേഷനായുള്ള നിരന്തരമായ തിരച്ചിൽ കാരണം ഇടപെടലുകൾ വളരെ ക്ഷണികമായി തുടരുന്നതിനാൽ ദ്രാവക ഗുണങ്ങൾ നിലനിർത്തുന്ന വലിയ സാന്ദ്രീകൃത പ്രോട്ടീൻ ലൈബ്രറികൾ ഇത് സൃഷ്ടിക്കുന്നു.രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, സ്വാഭാവികമായി ഉണ്ടാകുന്ന ചില ഐസോഫോംസ്62 ഉൾപ്പെടെ ടൗവിന്റെ N-അറ്റം വെട്ടിച്ചുരുക്കിയ രൂപങ്ങൾ ഇടത്തരം സ്വഭാവം പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു, ചില കോസർവേറ്റുകൾ αS-നൊപ്പം വാർദ്ധക്യം പ്രാപിക്കുകയും ജെൽ പോലുള്ള തുള്ളികളായി മാറുകയും മറ്റുള്ളവ വലിയ ദ്രാവക കണ്ടൻസേറ്റുകളായി മാറുകയും ചെയ്യുന്നു.αS ഇലക്‌ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് കോസർവേറ്റുകളുടെ പക്വതയിലെ ഈ ദ്വിത്വം സമീപകാല LLPS സൈദ്ധാന്തികവും പരീക്ഷണാത്മകവുമായ പഠനങ്ങളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു, ഇത് കണ്ടൻസേറ്റ് വലുപ്പവും ദ്രാവക ഗുണങ്ങളും നിയന്ത്രിക്കുന്നതിനുള്ള ഒരു താക്കോലായി കണ്ടൻസേറ്റുകളിലെ വാലൻസി ശോഷണവും ഇലക്‌ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് അരിപ്പയും തമ്മിലുള്ള പരസ്പരബന്ധം തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുണ്ട്.മെക്കാനിസം 58.61.
ഈ സ്കീം എൽഎൽപിഎസ്, എൽഎസ്പിടി വഴി αS, Tau441 എന്നിവയ്ക്കുള്ള അമിലോയ്ഡ് അഗ്രഗേഷൻ പാത കാണിക്കുന്നു.അധിക അയോണുകളാൽ സമ്പുഷ്ടമായ (ചുവപ്പ്), കാറ്റേഷൻ സമ്പന്നമായ (നീല) പ്രദേശങ്ങൾക്കൊപ്പം, തൃപ്തികരമായ വാലൻസുള്ള αS, ടൗ ഇലക്‌ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് കോസർവേറ്റുകൾക്ക് ഉപരിതല ഊർജം കുറവാണ്, അതിനാൽ ദ്രുതഗതിയിലുള്ള തുള്ളി വാർദ്ധക്യത്തിന് കാരണമാകുന്നു.ഒരു സ്ഥിരതയുള്ള നോൺ-അഗ്ലോമറേറ്റഡ് ജെൽ അവസ്ഥ കൈവരിക്കുന്നു..αS/pLK സിസ്റ്റത്തിന്റെ കാര്യത്തിൽ ഈ സാഹചര്യം വളരെ അനുകൂലമാണ്, കാരണം അതിന്റെ ഉയർന്ന അടുപ്പവും ലളിതമായ പ്രോട്ടീൻ-ജോഡി ഇന്ററാക്ഷൻ നെറ്റ്‌വർക്കും കാരണം, ഇത് വേഗത്തിലുള്ള ജെൽ പോലെയുള്ള പരിവർത്തനത്തിന് അനുവദിക്കുന്നു.നേരെമറിച്ച്, തൃപ്തികരമല്ലാത്ത വാലൻസി ഉള്ള തുള്ളികൾ, അതിനാൽ, പ്രോട്ടീൻ ചാർജ്ജ് ചെയ്ത പ്രദേശങ്ങൾ പരസ്പര പ്രവർത്തനത്തിന് ലഭ്യമാണ്, കോസർവേറ്റിന്റെ ഉയർന്ന ഉപരിതല ഊർജ്ജം കുറയ്ക്കുന്നതിന് ഹൈഡ്രോഫിലിക് ഉപരിതലത്തെ ഫ്യൂസ് ചെയ്യാനും നനയ്ക്കാനും എളുപ്പമാക്കുന്നു.ദുർബലമായ Tau-Tau, αS-Tau ഇടപെടലുകൾ അടങ്ങിയ മൾട്ടിവാലന്റ് കോംപ്ലക്സ് നെറ്റ്‌വർക്ക് ഉള്ള αS/Tau441 കോസർവേറ്റുകൾക്ക് ഈ സാഹചര്യം അഭികാമ്യമാണ്.അതാകട്ടെ, വലിയ കോസർവേറ്റുകൾ അവയുടെ ദ്രാവകം പോലുള്ള ഗുണങ്ങൾ കൂടുതൽ എളുപ്പത്തിൽ നിലനിർത്തുകയും മറ്റ് പ്രോട്ടീൻ-ടു-പ്രോട്ടീൻ ഇടപെടലുകൾ ഉണ്ടാകാൻ അനുവദിക്കുകയും ചെയ്യും.ആത്യന്തികമായി, കോസർവേറ്റ് ദ്രാവകത്തിനുള്ളിൽ αS ഉം ടൗവും അടങ്ങിയ അമിലോയിഡ് വൈവിധ്യമാർന്ന അഗ്രഗേറ്റുകൾ രൂപം കൊള്ളുന്നു, ഇത് ന്യൂറോ ഡിജനറേറ്റീവ് രോഗങ്ങളുടെ മുഖമുദ്രയായ ഇൻക്ലൂഷൻ ബോഡികളിൽ കാണപ്പെടുന്നവയുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കാം.
വളരെ തിരക്കേറിയതും എന്നാൽ ചലനാത്മകവുമായ പ്രോട്ടീൻ പരിതസ്ഥിതിയിൽ αS/Tau441 പക്വത പ്രാപിക്കുന്ന സമയത്ത് രൂപപ്പെടുന്ന വലിയ ദ്രാവകം പോലെയുള്ള ഘടനകളും, ഒരു പരിധിവരെ, αS/ΔNt-Tau കോസർവേറ്റുകളും പ്രോട്ടീൻ സംയോജനത്തിന്റെ ന്യൂക്ലിയേഷനായി അനുയോജ്യമായ റിസർവോയറുകളാണ്.ഈ തരത്തിലുള്ള പ്രോട്ടീൻ കോസർവേറ്റുകളിൽ സോളിഡ് പ്രോട്ടീൻ അഗ്രഗേറ്റുകളുടെ രൂപീകരണം ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു, പലപ്പോഴും αS ഉം tau ഉം അടങ്ങിയിട്ടുണ്ട്.ഈ ഹെറ്ററോഗ്രഗേറ്റുകൾ ഇലക്ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് ഇതര ഇടപെടലുകളാൽ സ്ഥിരത കൈവരിക്കുമെന്നും സാധാരണ അമിലോയിഡ് ഫൈബ്രിലുകളുടെ അതേ രീതിയിൽ അമിലോയിഡ്-നിർദ്ദിഷ്ട ThT ഡൈകളെ ബന്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയുമെന്നും വ്യത്യസ്ത സ്വാധീനങ്ങൾക്ക് സമാനമായ പ്രതിരോധം ഉണ്ടെന്നും ഞങ്ങൾ കാണിച്ചു.LLPS രൂപീകരിച്ച αS/tau അഗ്രഗേറ്റുകൾക്ക് അമിലോയിഡ് പോലെയുള്ള ഗുണങ്ങളുണ്ടെന്ന് കാണിക്കുന്നു.വാസ്തവത്തിൽ, ദ്രാവക ഇലക്ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് കോസർവേറ്റിനുള്ളിൽ ഈ വൈവിധ്യമാർന്ന αS അഗ്രഗേറ്റുകളുടെ രൂപീകരണത്തിൽ അമിലോയിഡ് അഗ്രഗേഷനിൽ ടൗ കുറവുള്ള പക്വമായ വേരിയന്റ് ഗണ്യമായി തകരാറിലാകുന്നു.αS/Tau441 അഗ്രഗേറ്റുകളുടെ രൂപീകരണം കോസർവേറ്റിനുള്ളിൽ മാത്രമേ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടിട്ടുള്ളൂ, അത് ദ്രാവകരൂപത്തിലുള്ള ഗുണങ്ങൾ നിലനിർത്തി, ഒരിക്കലും, കോസർവേറ്റുകൾ/തുള്ളികൾ ജെൽ അവസ്ഥയിൽ എത്തിയില്ലെങ്കിൽ.പിന്നീടുള്ള സന്ദർഭത്തിൽ, ഇലക്ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് ഇടപെടലുകളുടെ വർദ്ധിച്ച ശക്തിയും, അതിന്റെ ഫലമായി, പ്രോട്ടീൻ ശൃംഖലയുടെ കാഠിന്യവും, അമിലോയിഡ് ന്യൂക്ലിയേഷന് ആവശ്യമായ പുതിയ പ്രോട്ടീൻ ഇടപെടലുകൾ സ്ഥാപിക്കുന്നതിന് പ്രോട്ടീനുകളുടെ ആവശ്യമായ അനുരൂപമായ പുനഃക്രമീകരണത്തെ തടയുന്നു.എന്നിരുന്നാലും, കൂടുതൽ അയവുള്ളതും ദ്രാവകം പോലെയുള്ളതുമായ കോസർവേറ്റുകളിൽ ഇത് നേടാനാകും, അവയുടെ വലുപ്പം കൂടുന്നതിനനുസരിച്ച് ദ്രാവകമായി തുടരാനുള്ള സാധ്യത കൂടുതലാണ്.
വലിയ αS/Tau കണ്ടൻസേറ്റുകളിൽ ഘനീഭവിച്ച ഘട്ടത്തിനുള്ളിലെ അഗ്രഗേറ്റുകളുടെ രൂപീകരണം, അതിവേഗം ജെൽ ചെയ്യുന്ന ചെറിയ തുള്ളികളേക്കാൾ അഭികാമ്യമാണ് എന്ന വസ്തുത, തുള്ളികളുടെ സംയോജനത്തെ നിയന്ത്രിക്കുന്ന ഘടകങ്ങളെ തിരിച്ചറിയുന്നതിന്റെ പ്രസക്തി എടുത്തുകാണിക്കുന്നു.അതിനാൽ, ഘട്ടം വേർതിരിക്കുന്നതിനുള്ള പ്രവണത മാത്രമല്ല, ശരിയായ പ്രവർത്തനത്തിനും രോഗ പ്രതിരോധത്തിനും കണ്ടൻസേറ്റിന്റെ വലുപ്പം നിയന്ത്രിക്കേണ്ടതുണ്ട്58,61.αS/Tau സിസ്റ്റത്തിനായുള്ള LLPS-യും LSPT-യും തമ്മിലുള്ള സന്തുലിതാവസ്ഥയുടെ പ്രാധാന്യവും ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ എടുത്തുകാണിക്കുന്നു.സാച്ചുറേഷൻ സാഹചര്യങ്ങളിൽ ലഭ്യമായ പ്രോട്ടീൻ മോണോമറുകളുടെ അളവ് കുറയ്ക്കുന്നതിലൂടെ തുള്ളി രൂപീകരണം അമിലോയിഡ് അഗ്രഗേഷനിൽ നിന്ന് സംരക്ഷിക്കപ്പെടുമെങ്കിലും, മറ്റ് സിസ്റ്റങ്ങളിൽ നിർദ്ദേശിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, 63,64, ഉയർന്ന തുള്ളികളുടെ തലത്തിലുള്ള തുള്ളി സംയോജനം സാവധാനത്തിലുള്ള അനുരൂപമായ പുനഃക്രമീകരണത്തിലൂടെ ആന്തരിക പ്രോട്ടീൻ സംയോജനത്തിലേക്ക് നയിച്ചേക്കാം.പ്രോട്ടീൻ നെറ്റ്‌വർക്കുകൾ..
മൊത്തത്തിൽ, എൽഎസ്‌പിടിയുടെ പശ്ചാത്തലത്തിൽ ഡ്രോപ്പ് നെറ്റ്‌വർക്കുകളിലെ സംയോജിത വാലൻസിയുടെയും സംതൃപ്തമായ/അസംതൃപ്തമായ ഇടപെടലുകളുടെയും പ്രസക്തിയെ ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ ശക്തമായി ഊന്നിപ്പറയുന്നു.പ്രത്യേകിച്ചും, പൂർണ്ണ ദൈർഘ്യമുള്ള αS/Tau441 കണ്ടൻസേറ്റുകൾക്ക് കാര്യക്ഷമമായി സംയോജിപ്പിക്കാനും ന്യൂക്ലിയേറ്റ് ചെയ്യാനും പ്രോട്ടീനുകൾ ഉൾപ്പെടുന്ന അമിലോയിഡ് പോലുള്ള ഭിന്നസംഖ്യകൾ രൂപപ്പെടുത്താനും ഞങ്ങളുടെ പരീക്ഷണ ഫലങ്ങളെ അടിസ്ഥാനമാക്കി ഒരു തന്മാത്രാ സംവിധാനം നിർദ്ദേശിക്കാനും കഴിയുമെന്ന് ഞങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു.ഞങ്ങൾ ഇവിടെ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുന്ന αS/Tau ഫ്ലൂയിഡ് കോസർവേറ്റിലെ രണ്ട് പ്രോട്ടീനുകളുടെ കോ-അഗ്രഗേഷൻ, ഉൾപ്പെടുത്തലുകളിലെ രണ്ട് പ്രോട്ടീനുകളുടെ സഹ-പ്രാദേശികവൽക്കരണവുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കാം, അവ രോഗത്തിന്റെ മുഖമുദ്രയാണ്, കൂടാതെ LLPS-ഉം LLPS-ഉം തമ്മിലുള്ള ബന്ധം മനസ്സിലാക്കാൻ സഹായിച്ചേക്കാം. അമിലോയിഡ് അഗ്രഗേഷൻ, ന്യൂറോ ഡിജനറേഷനിൽ ഉയർന്ന ചാർജുള്ള ഐഡിപിക്ക് വഴിയൊരുക്കുന്നു.
മോണോമെറിക് WT-αS, സിസ്റ്റൈൻ മ്യൂട്ടന്റ്‌സ് (Q24C-αS, N122C-αS), ΔCt-αS വകഭേദങ്ങൾ (Δ101-140) എന്നിവ E. coli-ൽ പ്രകടിപ്പിക്കുകയും മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ ശുദ്ധീകരിക്കുകയും ചെയ്തു.ഡിസൾഫൈഡ് ബോണ്ട് രൂപീകരണം തടയുന്നതിനായി αS സിസ്റ്റൈൻ മ്യൂട്ടന്റുകളുടെ ശുദ്ധീകരണത്തിലെ എല്ലാ ഘട്ടങ്ങളിലും 5 mM DTT ഉൾപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട്.Tau441 ഐസോഫോം (Addgene #16316-ൽ നിന്ന് ലഭിച്ച പ്ലാസ്മിഡ്), ΔNt-Tau വേരിയൻറ് (Δ1–150, CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACGCGG, CATGTATATCCTCTCTTCTTAA1-AggDAF1-AggDAF7-12,AGTAAGTTAA) GGCTC5 പ്രൈമർ ഉപയോഗിച്ച് നിർവചിക്കപ്പെട്ടത്) E. coli സംസ്കാരങ്ങൾ ആയിരുന്നു 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിലും 180 ആർപിഎമ്മിലും OD600 = 0.6-0.7 ആയി വളർന്നു, കൂടാതെ 37 ° C താപനിലയിൽ 3 മണിക്കൂർ IPTG ഉപയോഗിച്ച് എക്സ്പ്രഷൻ പ്രേരിപ്പിച്ചു.4 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 15 മിനിറ്റ് 11,500 xg കോശങ്ങൾ വിളവെടുക്കുക, 150 mM NaCl അടങ്ങിയ സലൈൻ ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് കഴുകുക.ലിസിസ് ബഫറിൽ പെല്ലറ്റ് വീണ്ടും സസ്പെൻഡ് ചെയ്യുക (1 എൽ എൽബിക്ക് 20 മില്ലി: MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0.2 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidine 50 μM1, copeptin 50 μM1).10 പൾസുകൾക്ക് (1 മിനിറ്റ് ഓൺ, 1 മിനിറ്റ് ഓഫ്) 80% ആംപ്ലിറ്റ്യൂഡ് ഐസിൽ സോണിക്കേഷൻ സ്റ്റെപ്പ് നടത്തി.ഒരു അൾട്രാസൗണ്ടിൽ 60 മില്ലിയിൽ കൂടരുത്.E. coli lysates 20 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 95° C. ചൂടാക്കി, പിന്നീട് ഐസിൽ തണുപ്പിക്കുകയും 40 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 127,000×g സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.വ്യക്തമാക്കിയ സൂപ്പർനാറ്റന്റ് 3.5 kDa മെംബ്രണിൽ (സ്പെക്ട്രം™ തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്, യുകെ) പ്രയോഗിക്കുകയും 4 എൽ ഡയാലിസിസ് ബഫറിനെതിരെ ഡയാലിസ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു (20 mM MES, pH 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 m2 mMCl2, MGMCl2 , PMSF 0.1 mM) 10 മണിക്കൂർ.5 മില്ലി കേഷൻ എക്സ്ചേഞ്ച് കോളം (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) ഇക്വിലിബ്രേഷൻ ബഫർ (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 m) ഉപയോഗിച്ച് സമതുലിതമാക്കി.ടൗ ലൈസേറ്റ് 0.22 μm PVDF ഫിൽട്ടറിലൂടെ ഫിൽട്ടർ ചെയ്യുകയും 1 മില്ലി / മിനിറ്റ് ഫ്ലോ റേറ്റിൽ കോളത്തിലേക്ക് കുത്തിവയ്ക്കുകയും ചെയ്തു.എല്യൂഷൻ ക്രമേണ നടത്തി, 15-30% എല്യൂഷൻ ബഫർ (20 mM MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF) ഉപയോഗിച്ച് ടൗ എല്യൂട്ടുചെയ്‌തു.ഭിന്നസംഖ്യകൾ SDS-PAGE വിശകലനം ചെയ്‌തു, കൂടാതെ ടൗവിന്റെ തന്മാത്രാഭാരമുള്ള ഒരു ബാൻഡ് അടങ്ങിയ ഏതെങ്കിലും ഭിന്നസംഖ്യകൾ 10 kDa സെൻട്രിഫ്യൂജ് ഫിൽട്ടർ ഉപയോഗിച്ച് കേന്ദ്രീകരിക്കുകയും പകരം 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM, DTT 2 mM എന്നിവ അടങ്ങിയ ഒരു ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് മാറ്റിസ്ഥാപിക്കുകയും ചെയ്തു. അവസാന പ്രോട്ടീൻ സാന്ദ്രത 100 μM ആയിരുന്നു.പ്രോട്ടീൻ ലായനി 0.22 μm പിവിഡിഎഫ് ഫിൽട്ടറിലൂടെ കടന്നുപോയി, പെട്ടെന്ന് ഫ്രീസുചെയ്‌ത് -80 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ സൂക്ഷിക്കുന്നു.പ്രോട്ടീൻ കെ 18 പ്രൊഫ. ആൽബർട്ടോ ബോഫി ദയയോടെ നൽകി.SDS-PAGE, MALDI-TOF/TOF എന്നിവ സ്ഥിരീകരിച്ച പ്രകാരം തയ്യാറാക്കലിന്റെ പരിശുദ്ധി >95% ആയിരുന്നു.വിവിധ സിസ്റ്റൈനുകൾ AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) അല്ലെങ്കിൽ TEMPOL-maleimide (ടൊറന്റോ റിസർച്ച് കെമിക്കൽസ്, ടൊറന്റോ, കാനഡ) ഉപയോഗിച്ച് രാസപരമായി ലേബൽ ചെയ്തിട്ടുണ്ട്.ആഗിരണം, MALDI-TOF/TOF എന്നിവയിലൂടെ സ്ഥിരീകരിച്ചു.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau, K18 എന്നിവ അതേ നടപടിക്രമം പാലിച്ച് Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, ജർമ്മനി) ഉപയോഗിച്ച് 191, 322 സ്ഥാനങ്ങളിൽ നേറ്റീവ് സിസ്റ്റൈൻ അവശിഷ്ടങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച് ലേബൽ ചെയ്‌തു.CIDER66 ഉപയോഗിച്ച് αS, Tau441 എന്നിവയ്‌ക്കായുള്ള ഓരോ അവശിഷ്ട മാപ്പുകളുടെയും നെറ്റ് ചാർജ് ജനറേറ്റുചെയ്‌തു.
സോളിഡ് പോളി-എൽ-ലൈസിൻ (വിതരണക്കാരിൽ നിന്നുള്ള NMR അനുസരിച്ച് pLK DP 90-110, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.4 മുതൽ 10 mM വരെ സോണിക്കേറ്റഡ് കോൺസൺട്രേഷൻ, 5 പ്രോസസ്സ് സോണിക്കേറ്റഡ് കോൺസൺട്രേഷൻ ഒരു അൾട്രാസോണിക് വാട്ടർ ബാത്തിൽ മിനിറ്റ് -20 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ സൂക്ഷിക്കുക.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA), FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, USA) എന്നിവ വെള്ളത്തിൽ ലയിക്കുന്നതും LLPS ബഫറിൽ വ്യാപകമായി വിതരണം ചെയ്യപ്പെടുന്നതുമാണ്.ഡയാലിസിസ് മലിനമായ ലവണങ്ങൾ നീക്കം ചെയ്യുന്നു.0.22 μm സുഷിര വലുപ്പമുള്ള ഒരു സിറിഞ്ച് ഫിൽട്ടറിലൂടെ അവ ഫിൽട്ടർ ചെയ്യുകയും ഒരു റിഫ്രാക്ടോമീറ്റർ (മെറ്റ്ലർ ടോളിഡോ, കൊളംബസ്, ഒഹായോ, യുഎസ്എ) ഉപയോഗിച്ച് അവയുടെ സാന്ദ്രത കണക്കാക്കുകയും ചെയ്തു.താഴെപ്പറയുന്ന ക്രമത്തിൽ ഊഷ്മാവിൽ LLPS സാമ്പിളുകൾ തയ്യാറാക്കി: ബഫറും എക്സ്ട്രൂഷനും മിക്സഡ് ചെയ്തു കൂടാതെ 1 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Ethane- 1, 2-ഡൈൽഡിനിട്രൈൽ) ടെട്രാസെറ്റിക് ആസിഡും (EDTA, കാർബോക്സിന്ത്) 1% പ്രോട്ടീസ് ഇൻഹിബിറ്ററിന്റെ മിശ്രിതവും (PMSF 100 mM, benzimide 1 mM, leupeptin 5 μM).തുടർന്ന് αS ഉം ഫ്യൂസ്ഡ് പോളിക്കേഷനുകളും (ഓപ്ഷനുകൾ pLK അല്ലെങ്കിൽ Tau) ചേർക്കുന്നു.thioflavin-T ടൈം സീരീസ് പരീക്ഷണങ്ങൾക്ക് (ThT, Carbosynth, Compton, UK), ആകെ ThT കോൺസൺട്രേഷൻ αS സാന്ദ്രതയുടെ പകുതിയായി ഉപയോഗിക്കുക.സാമ്പിളുകൾ ഏകതാനമാണെന്ന് ഉറപ്പാക്കാൻ സൌമ്യമായി എന്നാൽ നന്നായി മിക്സ് ചെയ്യുക.ഫല വിഭാഗത്തിൽ വിവരിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, ഓരോ ഘടകത്തിന്റെയും ഏകാഗ്രത ഓരോ പരീക്ഷണത്തിനും വ്യത്യസ്തമാണ്.പരീക്ഷണത്തിന്റെ ദൈർഘ്യം 4 മണിക്കൂർ കവിയുമ്പോഴെല്ലാം 0.02% (w/v) സാന്ദ്രതയിലാണ് അസൈഡ് ഉപയോഗിച്ചത്.LLPS സാമ്പിളുകൾ ഉപയോഗിക്കുന്ന എല്ലാ വിശകലനങ്ങൾക്കും, വിശകലനത്തിന് 5 മിനിറ്റ് മുമ്പ് മിശ്രിതം സമനിലയിലാക്കാൻ അനുവദിക്കുക.ലൈറ്റ് സ്‌കാറ്ററിംഗ് വിശകലനത്തിനായി, 150 µl സാമ്പിളുകൾ നോൺ-ബൈൻഡിംഗ് 96-കിണർ മൈക്രോപ്ലേറ്റുകളിലേക്ക് (µClear®, ബ്ലാക്ക്, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) കയറ്റി, പശ ഫിലിം കൊണ്ട് പൊതിഞ്ഞു.ഒരു CLARIOstar പ്ലേറ്റ് റീഡറിൽ (BMG Labtech, Ortenberg, ജർമ്മനി) ലായനിയുടെ മധ്യഭാഗത്ത് 350 nm-ൽ ആഗിരണം ചെയ്യുന്നതിലൂടെ LLP-കൾ നിരീക്ഷിച്ചു.പരീക്ഷണങ്ങൾ 25 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ മൂന്നിരട്ടിയായി നടത്തി, പിശകുകൾ ശരാശരിയിൽ നിന്നുള്ള സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷൻ ആയി കണക്കാക്കി.സാമ്പിൾ സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷനും SDS-PAGE ജെൽ വിശകലനവും വഴി നേർപ്പിച്ച ഘട്ടം കണക്കാക്കി, കൂടാതെ നേർപ്പിച്ചതും സാന്ദ്രീകൃതവുമായ ഘട്ടങ്ങളിലെ αS ഭിന്നസംഖ്യ വിവിധ LLPS സൊല്യൂഷനുകളിൽ കണക്കാക്കി.1 μM AF488-ലേബൽ ചെയ്‌ത αS അടങ്ങുന്ന 100 μl LLPS സാമ്പിൾ, 30 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 9600×g-ൽ സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ ചെയ്‌ത് നന്നായി മിക്‌സ് ചെയ്‌ത് തയ്യാറാക്കി, അതിനുശേഷം മഴ സാധാരണയായി ദൃശ്യമാകും.SDS-PAGE ജെൽ ഉപയോഗിച്ച് പ്രോട്ടീൻ ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷനായി സൂപ്പർനറ്റന്റിന്റെ മുകളിലെ 50 μl ഉപയോഗിച്ചു.ഒരു ChemiDoc ജെൽ ഇമേജിംഗ് സിസ്റ്റം (ബയോ-റാഡ് ലബോറട്ടറീസ്, ഹെർക്കുലീസ്, CA, USA) ഉപയോഗിച്ച് AF488 ഫിൽട്ടറുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ജെലുകൾ സ്കാൻ ചെയ്തു അല്ലെങ്കിൽ Coomassie സ്റ്റെയിൻ ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റെയിൻ ചെയ്ത് ഉചിതമായ ഫിൽട്ടറുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ദൃശ്യവൽക്കരിച്ചു.തത്ഫലമായുണ്ടാകുന്ന ബാൻഡുകൾ ImageJ പതിപ്പ് 1.53i (നാഷണൽ ഇൻസ്റ്റിറ്റ്യൂട്ട് ഓഫ് ഹെൽത്ത്, യുഎസ്എ) ഉപയോഗിച്ച് വിശകലനം ചെയ്തു.സമാന ഫലങ്ങളുള്ള രണ്ട് വ്യത്യസ്ത പരീക്ഷണങ്ങളിൽ പരീക്ഷണങ്ങൾ തനിപ്പകർപ്പായി നടത്തി.
സാധാരണഗതിയിൽ, 150 μl സാമ്പിളുകൾ നോൺ-ബൈൻഡിംഗ് 96-കിണർ മൈക്രോപ്ലേറ്റുകളിൽ പ്രയോഗിക്കുകയും ഒരു Leica DMI6000B വിപരീത മൈക്രോസ്കോപ്പിൽ (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) ഊഷ്മാവിൽ ദൃശ്യവൽക്കരിക്കുകയും ചെയ്തു.സ്പോട്ട് പരീക്ഷണങ്ങൾക്കായി, µ-സ്ലൈഡ് ആൻജിയോജെനിസിസ് പ്ലേറ്റുകളും (ഇബിഡി ജിഎംബിഎച്ച്, ഗ്രാഫെൽഫിംഗ്, ജർമ്മനി) അല്ലെങ്കിൽ 96-കിണർ പോളിസ്റ്റൈറൈൻ മൈക്രോപ്ലേറ്റുകളും (കോർണിംഗ് കോസ്റ്റാർ കോർപ്പറേഷൻ, ആക്റ്റൺ, മസാച്ചുസെറ്റ്സ്) ഉപയോഗിച്ചു.EL6000 ഹാലൊജൻ അല്ലെങ്കിൽ മെർക്കുറി മെറ്റൽ ഹാലൈഡ് ലാമ്പുകൾ പ്രകാശ സ്രോതസ്സുകളായി ഉപയോഗിച്ചു (യഥാക്രമം BF/DIC, WF ഇമേജിംഗിനായി).WF മൈക്രോസ്കോപ്പിക്കായി, സാമ്പിളിൽ പ്രകാശം ഫോക്കസ് ചെയ്യാനും ശേഖരിക്കാനും 40x മാഗ്നിഫിക്കേഷൻ എയർ ഒബ്ജക്റ്റീവ് (ലൈക മൈക്രോസിസ്റ്റംസ്, ജർമ്മനി) ഉപയോഗിച്ചു.AF488, ThT ലേബൽ ചെയ്ത സാമ്പിളുകൾക്ക്, സ്റ്റാൻഡേർഡ് GFP ഫിൽട്ടർ സെറ്റുകൾ, എക്‌സിറ്റേഷൻ, എമിഷൻ ബാൻഡ്‌പാസ് ഫിൽട്ടറുകൾ എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് യഥാക്രമം 460–500 nm, 512–542 nm ബാൻഡ്‌പാസ് ഫിൽട്ടറുകൾ, 495 nm ഡൈക്രോയിക് മിറർ എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് ഫിൽട്ടർ എക്‌സിറ്റേഷനും എമിഷനും.Atto647N ഉപയോഗിച്ച് ലേബൽ ചെയ്‌ത സാമ്പിളുകൾക്കായി, യഥാക്രമം 628-40 nm, 692-40 nm ഉത്തേജനവും എമിഷൻ ബാൻഡ്‌പാസ് ഫിൽട്ടറുകളും ഉള്ള Cy5 ഫിൽട്ടറുകളുടെ ഒരു സാധാരണ സെറ്റ്, കൂടാതെ 660 nm ഡൈക്രോയിക് മിററും ഉപയോഗിച്ചു.BF, DIC മൈക്രോസ്‌കോപ്പിക്ക്, അതേ പ്രതിഫലിച്ച പ്രകാശ ശേഖരണ ലക്ഷ്യം ഉപയോഗിക്കുക.ശേഖരിച്ച വെളിച്ചം ലെയ്‌ക ഡിഎഫ്‌സി 7000 സിസിഡി ക്യാമറയിൽ (ലൈക്ക മൈക്രോസിസ്റ്റംസ്, ജർമ്മനി) റെക്കോർഡുചെയ്‌തു.BF, DIC മൈക്രോസ്കോപ്പി ഇമേജിംഗിന് 50 ms ഉം WF മൈക്രോസ്കോപ്പി ഇമേജിംഗിന് 20-100 ms ഉം ആയിരുന്നു എക്സ്പോഷർ സമയം.താരതമ്യത്തിന്, ThT യുമായുള്ള എല്ലാ പരീക്ഷണങ്ങളുടെയും എക്സ്പോഷർ സമയം 100 ms ആയിരുന്നു.ഓരോ 100 എം.എസിലും ഏതാനും മിനിറ്റുകൾക്കുള്ളിൽ ചിത്രങ്ങൾ ശേഖരിക്കുന്ന തരത്തിൽ ഡ്രോപ്ലെറ്റ് കോലസെൻസ് ദൃശ്യവൽക്കരിക്കാൻ ടൈം-ലാപ്സ് പരീക്ഷണങ്ങൾ നടത്തി.ഇമേജ് വിശകലനത്തിനായി ImageJ (NIH, USA) ഉപയോഗിച്ചു.സമാനമായ ഫലങ്ങളോടെ പരീക്ഷണങ്ങൾ മൂന്നിരട്ടിയായി നടത്തി.
കൊളോക്കലൈസേഷൻ പരീക്ഷണങ്ങൾക്കായി, FRAP, 3D പുനർനിർമ്മാണം, ZEN 2 നീല പതിപ്പ് (കാൾ സീസ് എജി, ഒബെർകോചെൻ, ജർമ്മനി) ഉപയോഗിച്ച് Zeiss LSM 880 വിപരീത കൺഫോക്കൽ മൈക്രോസ്കോപ്പിൽ ചിത്രങ്ങൾ സ്വന്തമാക്കി.50 µl ന്റെ സാമ്പിളുകൾ µ-സ്ലൈഡ് ആൻജിയോജെനിസിസ് പെട്രി വിഭവങ്ങളിൽ (Ibidi GmbH, Gröfelfing, ജർമ്മനി) പ്രയോഗിച്ചു, ഒരു ഹൈഡ്രോഫിലിക് പോളിമർ (ibiTreat) ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിക്കുകയും 63× ഓയിൽ ഇമ്മർഷൻ ഒബ്ജക്റ്റീവിൽ (Plan-Apochromat 1.4/ilNA) ഘടിപ്പിക്കുകയും ചെയ്തു. ഡിഐസിയിൽ).458 nm, 488 nm, 633 nm ആർഗൺ ലേസർ ലൈനുകൾ ഉപയോഗിച്ച് 0.26 µm/പിക്സൽ റെസല്യൂഷനും 8 µs/പിക്സലിന്റെ എക്സ്പോഷർ സമയവും ഉപയോഗിച്ച് 470–600 nm, 840 nm, 620 nm, പുറന്തള്ളൽ കണ്ടെത്തൽ വിൻഡോകൾ എന്നിവ ഉപയോഗിച്ചാണ് ചിത്രങ്ങൾ നേടിയത്. കൂടാതെ 638–755 nm യഥാക്രമം ThT, AF488, Atto647N എന്നിവ ദൃശ്യവൽക്കരിക്കാൻ ഉപയോഗിച്ചു.FRAP പരീക്ഷണങ്ങൾക്കായി, ഓരോ സാമ്പിളിന്റെയും ടൈം-ലാപ്സ് ഫോട്ടോഗ്രാഫി സെക്കൻഡിൽ 1 ഫ്രെയിമിൽ രേഖപ്പെടുത്തി.സമാനമായ ഫലങ്ങളോടെ മുറിയിലെ താപനിലയിൽ പരീക്ഷണങ്ങൾ മൂന്നിരട്ടിയായി നടത്തി.സെൻ 2 ബ്ലൂ എഡിഷൻ സോഫ്‌റ്റ്‌വെയർ (കാൾ സീസ് എജി, ഒബർകോചെൻ, ജർമ്മനി) ഉപയോഗിച്ചാണ് എല്ലാ ചിത്രങ്ങളും വിശകലനം ചെയ്തത്.ഒറിജിൻപ്രോ 9.1 ഉപയോഗിച്ച് സെൻ 2 ഉപയോഗിച്ച് ചിത്രങ്ങളിൽ നിന്ന് എക്‌സ്‌ട്രാക്‌റ്റുചെയ്‌ത തീവ്രത/സമയ ഡാറ്റയിലേക്ക് FRAP കർവുകൾ നോർമലൈസ് ചെയ്യുകയും പ്ലോട്ട് ചെയ്യുകയും ഘടിപ്പിക്കുകയും ചെയ്‌തു.വീണ്ടെടുക്കൽ കർവുകൾ മോണോ-എക്‌സ്‌പോണൻഷ്യൽ മോഡലിൽ ഘടിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു, മോളിക്യുലാർ ഡിഫ്യൂഷനും അക്വിസിഷൻ ബ്ലീച്ചിംഗ് ഇഫക്റ്റും കണക്കാക്കാൻ ഒരു അധിക എക്‌സ്‌പോണൻഷ്യൽ ടേം.നാമമാത്രമായ ബ്ലീച്ചിംഗ് റേഡിയസും മുമ്പ് നിശ്ചയിച്ച വീണ്ടെടുക്കൽ അർദ്ധായുസ്സും ഉപയോഗിച്ച് ഞങ്ങൾ D കണക്കാക്കി.5 35 കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.
24 (TEMPOL-24-αS), 122 (TEMPOL-122-αS) സ്ഥാനങ്ങളിൽ 4-ഹൈഡ്രോക്‌സി-2,2,6,6-ടെട്രാമെഥൈൽപിപെരിഡിൻ-എൻ-ഓക്‌സിൽ (TEMPOL) ഉപയോഗിച്ച് αS-ന്റെ സിംഗിൾ സിസ്റ്റൈൻ വകഭേദങ്ങൾ സമന്വയിപ്പിച്ചു. യഥാക്രമം.സ്പിൻ ലേബലിംഗ് EPR പരീക്ഷണങ്ങൾക്കായി, αS കോൺസൺട്രേഷൻ 100 μM ആയി സജ്ജീകരിച്ചു, PEG കോൺസൺട്രേഷൻ 15% (w/v) ആയിരുന്നു.വിവിധ അഗ്രഗേഷൻ വ്യവസ്ഥകൾക്കായി, αS:pLK അനുപാതം 1:10 ആയിരുന്നു, അതേസമയം αS:ΔNt-Tau, αS:Tau441 എന്നീ അനുപാതങ്ങൾ 1:1 ആയി നിലനിർത്തി.തിരക്കിന്റെ അഭാവത്തിൽ ബൈൻഡിംഗ് ടൈറ്ററേഷൻ പരീക്ഷണങ്ങൾക്കായി, TEMPOL-122-αS 50 μM-ൽ നിലനിർത്തി, ഓരോ അവസ്ഥയും പ്രത്യേകം തയ്യാറാക്കിക്കൊണ്ട് വർദ്ധിച്ച സാന്ദ്രതയിൽ പോളിക്കേഷനുകൾ ടൈറ്റേറ്റ് ചെയ്തു.~9.7 GHz മൈക്രോവേവ് (SHF) ഫ്രീക്വൻസിയിൽ പ്രവർത്തിക്കുന്ന ബ്രൂക്കർ ER4118 SPT-N1 റെസൊണേറ്റർ ഘടിപ്പിച്ച ബ്രൂക്കർ ELEXSYS E580 X-ബാൻഡ് സ്പെക്ട്രോമീറ്റർ ഉപയോഗിച്ചാണ് CW-EPR അളവുകൾ നടത്തിയത്.താപനില 25 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ സജ്ജീകരിച്ചു, ഒരു ലിക്വിഡ് നൈട്രജൻ ക്രയോസ്റ്റാറ്റ് നിയന്ത്രിക്കുന്നു.4 മെഗാവാട്ട് പവർ, 0.1 mT മോഡുലേഷൻ ആംപ്ലിറ്റ്യൂഡ്, 100 kHz മോഡുലേഷൻ ആവൃത്തി എന്നിവയിൽ അപൂരിത സാഹചര്യങ്ങളിൽ സ്പെക്ട്ര ലഭിച്ചു.Tau441 അല്ലെങ്കിൽ ΔNt-Tau (യഥാർത്ഥ പ്രോട്ടീൻ സൊല്യൂഷനുകളിൽ നിലവിലുണ്ട്) അടങ്ങിയ സാമ്പിളുകളിൽ ഏജന്റ്സ് കുറയ്ക്കുന്നതിന്റെ ശേഷിക്കുന്ന സാന്ദ്രത കാരണം സാമ്പിളുകൾക്കിടയിലുള്ള സ്പിൻ സാന്ദ്രതയിലെ വ്യത്യാസങ്ങളും സ്പിൻ റിഡക്ഷൻ സാധ്യതയും ഒഴിവാക്കാൻ സ്പെക്ട്രൽ തീവ്രത സാധാരണമാക്കി.Matlab®67-ൽ നടപ്പിലാക്കിയ Easyspin സോഫ്റ്റ്‌വെയർ (v. 6.0.0-dev.34) ഉപയോഗിച്ച് നടത്തിയ EPR സ്പെക്ട്രൽ മോഡലിംഗിന്റെ ഫലമായാണ് g യുടെ നൽകിയിരിക്കുന്ന മൂല്യങ്ങൾ ലഭിച്ചത്.ഡാറ്റ മാതൃകയാക്കാൻ ഒന്ന്/രണ്ട് ഘടക ഐസോട്രോപിക് മോഡലുകൾ ഉപയോഗിച്ചു.എല്ലാ സിഗ്നലുകളും നോർമലൈസ് ചെയ്ത ശേഷം, ഓരോ സിമുലേഷനും അനുബന്ധ പരീക്ഷണ സ്പെക്ട്രത്തിൽ നിന്ന് കുറച്ചാണ് അവശിഷ്ടങ്ങൾ കണക്കാക്കുന്നത്.ബൈൻഡിംഗ് ടൈറ്ററേഷൻ വിശകലനത്തിനായി, നോർമലൈസ്ഡ് ഇപിആർ സ്പെക്ട്രത്തിന്റെ (IIII/III) രണ്ടാമത്തെ ബാൻഡിലേക്കുള്ള മൂന്നാമത്തെ ബാൻഡിന്റെ ആപേക്ഷിക തീവ്രത αS-ലേക്ക് പോളിക്കേഷനുകളുടെ ബൈൻഡിംഗ് നിരീക്ഷിക്കാൻ ഉപയോഗിച്ചു.ഡിസോസിയേഷൻ കോൺസ്റ്റന്റ് (കെഡി) കണക്കാക്കാൻ, തത്ഫലമായുണ്ടാകുന്ന വക്രം n സമാനവും സ്വതന്ത്രവുമായ ബൈൻഡിംഗ് സൈറ്റുകൾ അനുമാനിക്കുന്ന ഒരു ഏകദേശ മാതൃകയിൽ ഘടിപ്പിച്ചു.
ക്രയോപ്രോബും Z-ഗ്രേഡിയന്റും ഘടിപ്പിച്ച ബ്രൂക്കർ നിയോ 800 MHz (1H) NMR സ്പെക്ട്രോമീറ്റർ ഉപയോഗിച്ചാണ് എൻഎംആർ സ്പെക്ട്രോസ്കോപ്പി പരീക്ഷണങ്ങൾ നടത്തിയത്.എല്ലാ പരീക്ഷണങ്ങളും 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 എന്നിവയിൽ 130-207 µM αS ഉം അനുബന്ധ αS/ΔNt-Tau, pLK തത്തുല്യങ്ങളും ഉപയോഗിച്ചാണ് നടത്തിയത് കൂടാതെ 15°C-ൽ നടത്തി.NMR മുഖേന LPS നിരീക്ഷിക്കുന്നതിന്, പ്രീ-മിക്‌സ്ഡ് സാമ്പിളുകളിൽ 10% PEG ചേർത്തു.കെമിക്കൽ ഷിഫ്റ്റ് പെർടർബേഷൻ പ്ലോട്ട് (ചിത്രം 1 ബി) ശരാശരി 1H, 15N കെമിക്കൽ ഷിഫ്റ്റുകൾ കാണിക്കുന്നു.αS 2D1H-15N HSQC സ്പെക്‌ട്ര ഒരു മുൻ അസൈൻമെന്റിന്റെ (BMRB എൻട്രി #25227) അടിസ്ഥാനമാക്കി അസൈൻ ചെയ്‌തു, കൂടാതെ HNCA, HNCO, CBCAcoNH എന്നിവയുടെ 3D സ്പെക്‌ട്ര റെക്കോർഡുചെയ്‌ത് വിശകലനം ചെയ്‌ത് സ്ഥിരീകരിച്ചു.13Cα, 13Cβ കെമിക്കൽ ഷിഫ്റ്റുകൾ ΔNt-Tau അല്ലെങ്കിൽ pLK യുടെ സാന്നിധ്യത്തിൽ കണക്കാക്കി, പ്യുവർ റാൻഡം കോയിൽ കൺഫർമേഷൻ 68 ലെ αS കെമിക്കൽ ഷിഫ്റ്റുകളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ ദ്വിതീയ ഘടനാ പ്രവണതകളിൽ സാധ്യമായ മാറ്റങ്ങൾ അളക്കാൻ (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 5c).R1ρ നിരക്കുകൾ 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400, 800 ms എന്നിവയുടെ കാലതാമസത്തോടെ hsqctretf3gpsi പരീക്ഷണങ്ങൾ (ബ്രൂക്കർ ലൈബ്രറിയിൽ നിന്ന് ലഭിച്ചത്) റെക്കോർഡ് ചെയ്‌ത് അളന്നു, കൂടാതെ എക്‌സ്‌പോണൻഷ്യൽ ഫംഗ്‌ഷനുകൾ വ്യത്യസ്‌ത കാലതാമസത്തിന്റെ കൊടുമുടിയിൽ ക്രമീകരിച്ചു. R1ρ യും അതിന്റെ പരീക്ഷണാത്മക അനിശ്ചിതത്വവും നിർണ്ണയിക്കുന്നതിനുള്ള സമയം.
ടൈം-കോറിലേറ്റഡ് സിംഗിൾ ഫോട്ടോൺ കൗണ്ടിംഗ് (TCSPC) ഉപകരണം ഉപയോഗിച്ച് വാണിജ്യ സമയം-പരിഹരിച്ച MT200 ഫ്ലൂറസെൻസ് കൺഫോക്കൽ മൈക്രോസ്കോപ്പിൽ (PicoQuant, Berlin, Germany) രണ്ട്-വർണ്ണ സമയം-പരിഹരിച്ച ഫ്ലൂറസെൻസ് മൈക്രോസ്കോപ്പി പരീക്ഷണങ്ങൾ നടത്തി.ലേസർ ഡയോഡ് ഹെഡ് പൾസ്ഡ് ഇന്റർലീവ്ഡ് എക്‌സിറ്റേഷനായി (PIE) ഉപയോഗിക്കുന്നു, ബീം ഒരു സിംഗിൾ മോഡ് വേവ്‌ഗൈഡിലൂടെ കടന്നുപോകുകയും 481 nm, 637 nm ലേസർ ലൈനുകൾക്കായി 10 മുതൽ 100 ​​nW വരെയുള്ള ലേസർ പവറിലേക്ക് ട്യൂൺ ചെയ്യുകയും ചെയ്യുന്നു.ഇത് ഫോട്ടോൺ അപരവൽക്കരണം, ഫോട്ടോബ്ലീച്ചിംഗ്, സാച്ചുറേഷൻ എന്നിവയുടെ ഇഫക്റ്റുകൾ ഒഴിവാക്കിക്കൊണ്ട് ഒപ്റ്റിമൽ ഫോട്ടോൺ എണ്ണൽ നിരക്ക് ഉറപ്പാക്കുന്നു.μ-സ്ലൈഡ് ആൻജിയോജെനിസിസ് കവർസ്ലിപ്പുകളോ പ്ലേറ്റുകളോ (ഐബിഡി ജിഎംബിഎച്ച്, ഗ്രാഫെൽഫിംഗ്, ജർമ്മനി) ഒരു സൂപ്പർ അപ്പോക്രോമാറ്റ് 60x NA 1.2 ലെൻസിന് മുകളിലൂടെ നിമജ്ജന വെള്ളത്തിൽ നേരിട്ട് സ്ഥാപിച്ചു (ഒളിമ്പസ് ലൈഫ് സയൻസസ്, വാൾതം, യുഎസ്എ).ഒരു 488/640 nm ഡൈക്രോയിക് മിറർ (സെംറോക്ക്, ലേക് ഫോറസ്റ്റ്, IL, USA) പ്രധാന ബീം സ്പ്ലിറ്ററായി ഉപയോഗിച്ചു.ഫോക്കസ് ചെയ്യാത്ത വികിരണം 50 മൈക്രോൺ വ്യാസമുള്ള ഒരു ദ്വാരത്താൽ തടഞ്ഞിരിക്കുന്നു, തുടർന്ന് ഫോക്കസ് ചെയ്ത വികിരണം 50/50 ബീം സ്പ്ലിറ്റർ ഉപയോഗിച്ച് 2 കണ്ടെത്തൽ പാതകളായി തിരിച്ചിരിക്കുന്നു.ബാൻഡ്‌പാസ് എമിഷൻ ഫിൽട്ടറുകൾ (Semrock, Lake Forest, IL, USA) ഗ്രീൻ ഡൈക്ക് (AF488) 520/35 ഉം ചുവന്ന ചായത്തിന് (Atto647N) 690/70 ഉം ഡിറ്റക്ടറിന് മുന്നിൽ ഉപയോഗിച്ചു.സിംഗിൾ-ഫോട്ടോൺ അവലാഞ്ച് ഡയോഡുകൾ (SPAD) (മൈക്രോ ഫോട്ടോൺ ഉപകരണങ്ങൾ, ബോൾസാനോ, ഇറ്റലി) ഡിറ്റക്ടറുകളായി ഉപയോഗിച്ചു.വാണിജ്യപരമായി ലഭ്യമായ SymfoTime64 സോഫ്റ്റ്‌വെയർ (PicoQuant GmbH, Berlin, Germany) ഉപയോഗിച്ചാണ് ഡാറ്റാ ശേഖരണവും വിശകലനവും നടത്തിയത്.
μ-സ്ലൈഡ് ആൻജിയോജെനിസിസ് കിണറുകളിൽ അമ്പത് മൈക്രോലിറ്റർ LLPS സാമ്പിളുകൾ പ്രയോഗിച്ചു (Ibidi GmbH, Gräfelfing, ജർമ്മനി).തത്ഫലമായുണ്ടാകുന്ന ചിത്രങ്ങൾ സസ്പെൻഡ് ചെയ്ത തുള്ളികൾക്ക് ഒപ്റ്റിമൽ ഒബ്ജക്റ്റീവ് വർക്കിംഗ് ദൂരത്തിനായി കിണറിന്റെ അടിയിൽ നിന്ന് 20 µm വരെയും റാഫ്റ്റുകൾക്കും ഡോട്ടുകൾക്കും ~1 µm വരെയും ഫോക്കസ് ചെയ്തിരിക്കുന്നു, കുറഞ്ഞത് 0.25 µm/പിക്സലിന്റെ അക്ഷീയ റെസല്യൂഷനും 400 µs/പിക്സലിന്റെ കാലതാമസ സമയവുമാണ്.ഓരോ ചാനലിനും ശരാശരി പശ്ചാത്തല സിഗ്നൽ തീവ്രത (PBG, ശരാശരി + 2σ) അടിസ്ഥാനമാക്കി ഒരു തീവ്രത ത്രെഷോൾഡ് പ്രയോഗിച്ച് ഡാറ്റ തിരഞ്ഞെടുക്കുക, അങ്ങനെ ദ്രവരൂപത്തിലുള്ള പ്രോട്ടീൻ തുള്ളികൾ, ചങ്ങാടങ്ങൾ അല്ലെങ്കിൽ പാടുകൾ എന്നിവ മാത്രം തിരഞ്ഞെടുക്കപ്പെടും, ചിതറിക്കിടക്കുന്ന ഘട്ടത്തിൽ നിന്ന് സാധ്യമായ ഉത്ഭവം ഫിൽട്ടർ ചെയ്യുന്നു.ഓരോ ചാനലിന്റെയും (τ) ഓരോ ജീവിവർഗത്തിന്റെയും (τ) ആയുസ്സ് വിശകലനം ചെയ്യാൻ (AF488-ന് പച്ച, "g", ചുവപ്പ്, Atto647N-ന് "r"), തുള്ളികൾ, ചങ്ങാടങ്ങൾ അല്ലെങ്കിൽ പാടുകൾ എന്നിവ അടങ്ങിയ താൽപ്പര്യമുള്ള പ്രദേശങ്ങൾ (ROI-കൾ) ഞങ്ങൾ തിരഞ്ഞെടുത്തു (അനുബന്ധ ചിത്രം 1 ).8b) കൂടാതെ ഓരോ ചാനലിലും ടെയിൽ ഫിറ്റ് വിശകലനവും രണ്ട് ഘടക ശോഷണ മാതൃകയും ഉപയോഗിച്ച് അവയുടെ ആയുഷ്കാല ക്ഷയം (തുള്ളികൾ, ചങ്ങാടങ്ങൾ അല്ലെങ്കിൽ പാടുകൾ എന്നിവയ്ക്കായി τD, τR, τP എന്നിവ യഥാക്രമം സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 8c കാണുക) ഘടിപ്പിച്ചുകൊണ്ട് അവയെ ഉരുത്തിരിഞ്ഞു.τ ൽ നിന്ന് ശരാശരി τ.മൾട്ടി-എക്‌സ്‌പോണൻഷ്യൽ ഫിറ്റിനായി വളരെ കുറച്ച് ഫോട്ടോണുകൾ ഉൽപ്പാദിപ്പിച്ച ROI-കൾ വിശകലനത്തിൽ നിന്ന് ഒഴിവാക്കപ്പെട്ടു.ചങ്ങാടങ്ങൾക്കും ഡോട്ടുകൾക്കുമായി <104 ഫോട്ടോണുകളും തുള്ളികൾക്ക് 103 ഉം ആണ് ഉപയോഗിച്ച കട്ട്ഓഫ്.ഇമേജ് ഫീൽഡിലെ തുള്ളികൾ സാധാരണയായി ചെറുതും എണ്ണത്തിൽ കുറവുള്ളതുമായതിനാൽ, ഉയർന്ന തീവ്രത മൂല്യങ്ങളുള്ള ശോഷണ കർവുകൾ ലഭിക്കാൻ പ്രയാസമുള്ളതിനാൽ തുള്ളികൾക്കുള്ള പരിധി കുറവാണ്.ഫോട്ടോൺ ശേഖരണ പരിധിക്ക് മുകളിലുള്ള ഫോട്ടോൺ എണ്ണമുള്ള ROI-കളും വിശകലനത്തിനായി നിരസിച്ചു.എല്ലാ തീവ്രത ക്ഷയത്തിനും സമാനമായി നിലനിർത്തിക്കൊണ്ടുതന്നെ ഏറ്റവും കുറഞ്ഞ IRF ഇടപെടൽ ഉറപ്പാക്കാൻ, സേവന ജീവിതത്തിന്റെ ആരംഭം മുതൽ പരമാവധി 90% (ക്ഷയത്തിന്റെ പരമാവധി തീവ്രതയ്ക്ക് ശേഷം ചെറുതായി) തീവ്രതയോടെ താൽപ്പര്യമുള്ള മേഖലയിൽ നിന്ന് ലഭിച്ച തീവ്രത ക്ഷയ കർവ് പൊരുത്തപ്പെടുത്തുക. ക്രമീകരണങ്ങൾ ആപേക്ഷിക സമയ വിൻഡോ റാഫ്റ്റുകൾക്കും സ്പോട്ടുകൾക്കുമായി 25 മുതൽ 50 ROI വരെയും ഡ്രോപ്പുകൾക്കായി 15-25 ROI വരെയും വിശകലനം ചെയ്തു, കുറഞ്ഞത് 3 സ്വതന്ത്ര പരീക്ഷണങ്ങളിൽ നിന്ന് രേഖപ്പെടുത്തിയ 4-ലധികം പകർപ്പുകളിൽ നിന്ന് തിരഞ്ഞെടുത്ത ചിത്രങ്ങൾ.സ്പീഷീസുകൾ തമ്മിലുള്ള അല്ലെങ്കിൽ കോസർവേറ്റ് സിസ്റ്റങ്ങൾ തമ്മിലുള്ള സ്ഥിതിവിവരക്കണക്ക് വ്യത്യാസങ്ങൾ വിലയിരുത്തുന്നതിന് ടു-ടെയിൽഡ് ടി-ടെസ്റ്റുകൾ ഉപയോഗിച്ചു.ലൈഫ്ടൈമിന്റെ (τ) ഒരു പിക്സൽ-ബൈ-പിക്സൽ വിശകലനത്തിനായി, ഓരോ ചാനലിനുമുള്ള ഫീൽഡിലെ ആയുഷ്കാലത്തിന്റെ ആകെ അറ്റൻയുവേഷൻ കണക്കാക്കുകയും 2/3-ഘടകം എക്സ്പോണൻഷ്യൽ അറ്റൻവേഷൻ മോഡലിന്റെ ഏകദേശ കണക്കെടുപ്പ് നടത്തുകയും ചെയ്തു.ഓരോ പിക്സലിനും ലൈഫ് ടൈം അറ്റൻവേഷൻ മുമ്പ് കണക്കാക്കിയ τ മൂല്യങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച് ഘടിപ്പിച്ചു, അതിന്റെ ഫലമായി ഒരു സ്യൂഡോകോളർ FLIM ഫിറ്റ് ഇമേജ് ലഭിച്ചു.ടെയിൽ ഫിറ്റ് ലൈഫ് ടൈം റേഞ്ച് ഒരേ ചാനലിന്റെ എല്ലാ ചിത്രങ്ങളിലും ഒരുപോലെയായിരുന്നു, കൂടാതെ ഓരോ ശോഷണവും വിശ്വസനീയമായ ഫിറ്റ് നൽകാൻ ആവശ്യമായ ഫോട്ടോണുകൾ നിർമ്മിക്കുന്നു.FRET വിശകലനത്തിനായി, 100 ഫോട്ടോണുകളുടെ കുറഞ്ഞ തീവ്രത ത്രെഷോൾഡ് പ്രയോഗിച്ചാണ് പിക്സലുകൾ തിരഞ്ഞെടുത്തത്, ഇത് ശരാശരി 11 ഫോട്ടോണുകളുടെ പശ്ചാത്തല സിഗ്നൽ (FBG) ആണ്.ഓരോ ചാനലിന്റെയും ഫ്ലൂറസെൻസ് തീവ്രത പരീക്ഷണാത്മകമായി നിർണ്ണയിക്കപ്പെട്ട തിരുത്തൽ ഘടകങ്ങളാൽ ശരിയാക്കി: 69 സ്പെക്ട്രൽ ക്രോസ്‌സ്റ്റോക്ക് α 0.004, നേരിട്ടുള്ള ആവേശം β 0.0305, കണ്ടെത്തൽ കാര്യക്ഷമത γ 0.517.പിക്സൽ തലത്തിലുള്ള FRET കാര്യക്ഷമത ഇനിപ്പറയുന്ന സമവാക്യം ഉപയോഗിച്ച് കണക്കാക്കുന്നു:
ഇവിടെ FDD എന്നത് ദാതാവിന്റെ (പച്ച) ചാനലിൽ നിരീക്ഷിക്കപ്പെടുന്ന ഫ്ലൂറസെൻസ് തീവ്രതയാണ്, പരോക്ഷമായ ഉത്തേജനത്തിന് കീഴിൽ സ്വീകരിക്കുന്ന (ചുവപ്പ്) ചാനലിൽ നിരീക്ഷിക്കപ്പെടുന്ന ഫ്ലൂറസെൻസ് തീവ്രതയാണ് FDA, നേരിട്ടുള്ള ആവേശത്തിൽ (ചുവപ്പ്) ചാനലിൽ നിരീക്ഷിക്കപ്പെടുന്ന ഫ്ലൂറസെൻസ് തീവ്രതയാണ് FAA. PIE).ഫ്ലൂറസെൻസ് തീവ്രത പൾസുകൾ ചാനലിൽ നിരീക്ഷിക്കപ്പെടുന്നു).
25 µM ലേബൽ ചെയ്യാത്ത മോണോമെറിക് Tau441 (25 µM αS ഉള്ളതോ അല്ലാതെയോ) അടങ്ങുന്ന 100 µl LLPS റിയാക്ഷൻ സൊല്യൂഷനുകൾ LLPS ബഫറിൽ സ്ഥാപിക്കുക (മുകളിൽ നൽകിയിരിക്കുന്നത് പോലെ) സമതുലിതാവസ്ഥ.10 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ.ഊഷ്മാവിൽ 48 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേഷൻ നടത്തിയ ശേഷം, പ്രോട്ടീൻ റാഫ്റ്റുകളുടെയും പാടുകളുടെയും സാന്നിധ്യം സ്ഥിരീകരിച്ചു.തുടർന്ന് കിണറുകളിൽ നിന്ന് റാഫ്റ്റുകൾക്ക് മുകളിലുള്ള ദ്രാവകം ശ്രദ്ധാപൂർവ്വം നീക്കം ചെയ്യുക, തുടർന്ന് 50 എൽ ഡിസോസിയേഷൻ ബഫർ (10 mM HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) ചേർത്ത് 10 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക.ഉയർന്ന ഉപ്പ് സാന്ദ്രത, ശേഷിക്കുന്ന PEG കാരണം LLPS ആവർത്തിക്കില്ലെന്ന് ഉറപ്പുനൽകുന്നു, കൂടാതെ ഇലക്ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് ഇടപെടലുകളാൽ മാത്രം രൂപപ്പെടുന്ന പ്രോട്ടീൻ അസംബ്ലികൾ വേർപെടുത്തപ്പെടും.കിണറിന്റെ അടിഭാഗം മൈക്രോപിപ്പറ്റ് ടിപ്പ് ഉപയോഗിച്ച് ശ്രദ്ധാപൂർവ്വം ചുരണ്ടുകയും തത്ഫലമായുണ്ടാകുന്ന പരിഹാരം ശൂന്യമായ ഒരു നിരീക്ഷണ കിണറിലേക്ക് മാറ്റുകയും ചെയ്തു.1 മണിക്കൂർ 50 μM ThT ഉള്ള സാമ്പിളുകൾ ഇൻകുബേഷൻ ചെയ്ത ശേഷം, ഒറ്റപ്പെട്ട പാടുകളുടെ സാന്നിധ്യം WF മൈക്രോസ്കോപ്പി പരിശോധിച്ചു.പിബിഎസിൽ 70-µM αS ലായനിയിൽ 300 µl, pH 7.4, സോഡിയം അസൈഡ് 0.01% 37 °C, 200 rpm എന്നിവ 7 ദിവസത്തേക്ക് ഓർബിറ്റൽ ഷേക്കറിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തുകൊണ്ട് സോണിക്കേറ്റഡ് αS ഫൈബ്രിലുകൾ തയ്യാറാക്കുക.ലായനി 30 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 9600×g-ൽ സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്തു, പെല്ലറ്റ് PBS pH 7.4-ൽ വീണ്ടും സസ്പെൻഡ് ചെയ്യുകയും സോണിക്കേറ്റ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു (1 മിനിറ്റ്, 50% സൈക്കിൾ, ഒരു വൈബ്ര-സെൽ VC130 സോണിക്കേറ്ററിൽ 80% ആംപ്ലിറ്റ്യൂഡ്, Sonics, Newton, USA) ഫൈബ്രിൽ സാമ്പിളുകൾ ചെറിയ ഫൈബ്രിലുകളുടെ താരതമ്യേന ഏകീകൃത വലിപ്പത്തിലുള്ള വിതരണത്തോടൊപ്പം.
PIE മോഡ് ഉപയോഗിച്ച് FLIM-FRET മൈക്രോസ്കോപ്പി പരീക്ഷണങ്ങൾക്കായി ഉപയോഗിക്കുന്ന MT200 ടൈം-റിസോൾവ്ഡ് ഫ്ലൂറസെന്റ് കൺഫോക്കൽ മൈക്രോസ്കോപ്പിൽ (Pico-Quant, Berlin, Germany) FCS/FCCS വിശകലനവും രണ്ട്-വർണ്ണ യാദൃശ്ചികത കണ്ടെത്തലും (TCCD) നടത്തി.ഈ പരീക്ഷണങ്ങൾക്കായുള്ള ലേസർ പവർ 6.0 µW (481 nm), 6.2 µW (637 nm) എന്നിവയിൽ ചേർത്തു.ഈ ലേസർ ശക്തികളുടെ സംയോജനം തിരഞ്ഞെടുത്തത് ഒപ്റ്റിമൽ കൗണ്ട് റേറ്റ് നേടുകയും ഫോട്ടോ ബ്ലീച്ചിംഗും സാച്ചുറേഷനും ഒഴിവാക്കുകയും ചെയ്യുമ്പോൾ ഉപയോഗിക്കുന്ന ഫ്ലൂറോഫോറുകളുടെ ജോഡികൾക്ക് സമാനമായ തെളിച്ചം സൃഷ്ടിക്കുന്നതിനാണ്.വാണിജ്യപരമായി ലഭ്യമായ SymfoTime64 പതിപ്പ് 2.3 സോഫ്റ്റ്‌വെയർ (PicoQuant, Berlin, Germany) ഉപയോഗിച്ചാണ് ഡാറ്റാ ശേഖരണവും വിശകലനവും നടത്തിയത്.
LLPS ഉപയോഗിച്ച് ലഭിച്ച ഒറ്റപ്പെട്ട αS/Tau അഗ്രഗേറ്റുകളുടെ സാമ്പിളുകൾ ഐസൊലേഷൻ ബഫറിൽ ഉചിതമായ മോണോമോളിക്യുലാർ കോൺസൺട്രേഷനിലേക്ക് ലയിപ്പിക്കുന്നു (സാധാരണയായി 1:500 നേർപ്പിക്കൽ, കാരണം കോസർവേറ്റ് സാമ്പിളുകളിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുക്കുമ്പോൾ അഗ്രഗേറ്റുകൾ ഇതിനകം കുറഞ്ഞ സാന്ദ്രതയിലാണ്).1 mg/mL എന്ന സാന്ദ്രതയിൽ BSA ലായനി ഉപയോഗിച്ച് മുൻകൂർ പൂശിയ കവർസ്ലിപ്പുകളിൽ (കോർണിംഗ്, യുഎസ്എ) സാമ്പിളുകൾ നേരിട്ട് പ്രയോഗിച്ചു.
പച്ച, ചുവപ്പ് ചാനലുകളിലെ PIE-smFRET വിശകലനത്തിനായി, മോണോമെറിക് ഇവന്റുകൾ മൂലമുണ്ടാകുന്ന കുറഞ്ഞ തീവ്രത സിഗ്നലുകൾ ഫിൽട്ടർ ചെയ്യുന്നതിന് 25 ഫോട്ടോണുകളുടെ കുറഞ്ഞ തീവ്രത ത്രെഷോൾഡ് പ്രയോഗിച്ചു (ഒറ്റപ്പെട്ട അഗ്രഗേറ്റുകളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ മോണോമറുകൾ മൊത്തം സാമ്പിളുകളെക്കാൾ കൂടുതലാണെന്നത് ശ്രദ്ധിക്കുക).ശുദ്ധമായ മോണോമർ സാമ്പിളുകളുടെ വിശകലനത്തിൽ നിന്ന് ലഭിച്ച മോണോമെറിക് αS ന്റെ ശരാശരി തീവ്രതയേക്കാൾ അഞ്ചിരട്ടിയായി ഈ പരിധി കണക്കാക്കി, വിശകലനത്തിനായി അഗ്രഗേറ്റുകൾ പ്രത്യേകമായി തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നതിന്.PIE ഡ്രൈവ് സർക്യൂട്ട്, ടി‌എസ്‌സി‌പി‌സി ഡാറ്റ ഏറ്റെടുക്കലിനൊപ്പം, പശ്ചാത്തലവും സ്പെക്ട്രൽ ക്രോസ്‌സ്റ്റോക്കും ഇല്ലാതാക്കാൻ സഹായിക്കുന്ന ലൈഫ് ടൈം വെയ്റ്റിംഗ് ഫിൽട്ടറിന്റെ പ്രയോഗം പ്രവർത്തനക്ഷമമാക്കി.മേൽപ്പറഞ്ഞ ത്രെഷോൾഡുകൾ ഉപയോഗിച്ച് തിരഞ്ഞെടുത്ത ഫ്ലെയർ തീവ്രത, ബഫർ-ഒൺലി സാമ്പിളുകളുടെ തീവ്രത/ബിൻ എന്നിവയ്‌ക്കെതിരായ ഹിസ്റ്റോഗ്രാമുകളിൽ നിന്ന് നിർണ്ണയിച്ച ശരാശരി പശ്ചാത്തല സിഗ്നൽ ഉപയോഗിച്ച് ശരിയാക്കി.വലിയ അഗ്രഗേറ്റുകളുമായി ബന്ധപ്പെട്ട പൊട്ടിത്തെറികൾ സാധാരണയായി ടൈം ട്രെയ്‌സിൽ തുടർച്ചയായി നിരവധി ബിന്നുകൾ ഉൾക്കൊള്ളുന്നു (1 ms ആയി സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്നു).ഈ സന്ദർഭങ്ങളിൽ, പരമാവധി ശക്തിയുള്ള ഒരു ബിൻ തിരഞ്ഞെടുത്തു.FRET, സ്റ്റോയ്ചിയോമെട്രിക് വിശകലനത്തിനായി, സൈദ്ധാന്തികമായി നിർണ്ണയിക്കപ്പെട്ട ഗാമാ ഘടകം γ (0.517) ഉപയോഗിച്ചു.ഉപയോഗിച്ച എക്‌സിറ്റേഷൻ ലേസർ പവറിൽ സ്‌പെക്ട്രൽ ക്രോസ്‌സ്റ്റോക്കും നേരിട്ടുള്ള എക്‌സിറ്റേഷൻ സംഭാവനകളും നിസ്സാരമാണ് (പരീക്ഷണപരമായി നിർണ്ണയിക്കുന്നത്).ഒരു സ്ഫോടനത്തിൽ FRET ന്റെ കാര്യക്ഷമതയും സ്റ്റോയ്ചിയോമെട്രിയും ഇനിപ്പറയുന്ന രീതിയിൽ കണക്കാക്കുന്നു.