Nature.com സന്ദർശിച്ചതിന് നന്ദി.പരിമിതമായ CSS പിന്തുണയുള്ള ഒരു ബ്രൗസർ പതിപ്പാണ് നിങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്നത്.മികച്ച അനുഭവത്തിനായി, നിങ്ങൾ ഒരു അപ്‌ഡേറ്റ് ചെയ്‌ത ബ്രൗസർ ഉപയോഗിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു (അല്ലെങ്കിൽ Internet Explorer-ൽ അനുയോജ്യത മോഡ് പ്രവർത്തനരഹിതമാക്കുക).കൂടാതെ, നിലവിലുള്ള പിന്തുണ ഉറപ്പാക്കാൻ, ഞങ്ങൾ ശൈലികളും JavaScript ഇല്ലാതെ സൈറ്റ് കാണിക്കുന്നു.
ഓരോ സ്ലൈഡിലും മൂന്ന് ലേഖനങ്ങൾ കാണിക്കുന്ന സ്ലൈഡറുകൾ.സ്ലൈഡുകളിലൂടെ നീങ്ങാൻ ബാക്ക്, അടുത്ത ബട്ടണുകൾ ഉപയോഗിക്കുക അല്ലെങ്കിൽ ഓരോ സ്ലൈഡിലൂടെയും നീങ്ങാൻ അവസാനത്തെ സ്ലൈഡ് കൺട്രോളർ ബട്ടണുകൾ ഉപയോഗിക്കുക.

317 സ്റ്റെയിൻലെസ്സ് സ്റ്റീൽ കോയിൽ ട്യൂബിംഗ് വിതരണക്കാർ

സ്റ്റെയിൻലെസ്സ് സ്റ്റീൽ മെറ്റീരിയലിന്റെ കെമിക്കൽ കോമ്പോസിഷൻ പട്ടിക

സസ്തനികളുടെ ലൈംഗിക പുനരുൽപ്പാദന സമയത്ത് ഗേമറ്റ് ഫ്യൂഷനിൽ നിർണായകമായ ഒരു ബീജം പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന ഉപരിതല പ്രോട്ടീനാണ് SPACA6.ഈ അടിസ്ഥാനപരമായ പങ്ക് ഉണ്ടായിരുന്നിട്ടും, SPACA6 ന്റെ നിർദ്ദിഷ്ട പ്രവർത്തനം മോശമായി മനസ്സിലാക്കപ്പെട്ടിട്ടില്ല.SPACA6-ന്റെ എക്‌സ്‌ട്രാ സെല്ലുലാർ ഡൊമെയ്‌നിന്റെ സ്‌ഫടിക ഘടന ഞങ്ങൾ 2.2 Å റെസല്യൂഷനിൽ വിശദീകരിക്കുന്നു, ഒരു ദ്വി-ഡൊമെയ്‌ൻ പ്രോട്ടീനും നാല് സ്ട്രാൻഡഡ് ബണ്ടിലും Ig-പോലുള്ള β-സാൻഡ്‌വിച്ചുകളും ചേർന്ന് ക്വാസി-ഫ്ലെക്‌സിബിൾ ലിങ്കറുകൾ ചേർന്നതാണ്.ഈ ഘടന IZUMO1, മറ്റൊരു ഗെയിമറ്റ് ഫ്യൂഷൻ-അസോസിയേറ്റഡ് പ്രോട്ടീനിനോട് സാമ്യമുള്ളതാണ്, SPACA6, IZUMO1 എന്നിവ ബീജസങ്കലനവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട പ്രോട്ടീനുകളുടെ സൂപ്പർ ഫാമിലിയിലെ സ്ഥാപക അംഗങ്ങളാക്കുന്നു.IST സൂപ്പർ ഫാമിലിയെ ഘടനാപരമായി നിർവചിച്ചിരിക്കുന്നത് അതിന്റെ വളച്ചൊടിച്ച നാല്-ഹെലിക്‌സ് ബണ്ടിലും ഒരു ജോടി ഡൈസൾഫൈഡ്-ലിങ്ക്ഡ് CXXC മോട്ടിഫുകളാലും ആണ്.ഹ്യൂമൻ പ്രോട്ടീമിന്റെ ഘടന അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ആൽഫഫോൾഡ് തിരയൽ ഈ സൂപ്പർ ഫാമിലിയിലെ അധിക പ്രോട്ടീൻ അംഗങ്ങളെ തിരിച്ചറിഞ്ഞു;പ്രധാനമായും, ഈ പ്രോട്ടീനുകളിൽ പലതും ഗെയിമറ്റ് ഫ്യൂഷനിൽ ഉൾപ്പെടുന്നു.SPACA6 ഘടനയും IST സൂപ്പർ ഫാമിലിയിലെ മറ്റ് അംഗങ്ങളുമായുള്ള അതിന്റെ ബന്ധവും സസ്തനികളുടെ ഗെയിമറ്റ് ഫ്യൂഷനെക്കുറിച്ചുള്ള നമ്മുടെ അറിവിൽ നഷ്‌ടമായ ലിങ്ക് നൽകുന്നു.
ഓരോ മനുഷ്യജീവിതവും ആരംഭിക്കുന്നത് രണ്ട് വ്യത്യസ്ത ഹാപ്ലോയിഡ് ഗെയിമറ്റുകളിൽ നിന്നാണ്: പിതാവിന്റെ ബീജവും അമ്മയുടെ അണ്ഡവും.ദശലക്ഷക്കണക്കിന് ബീജകോശങ്ങൾ സ്ത്രീ ജനനേന്ദ്രിയത്തിലൂടെ കടന്നുപോകുകയും വിവിധ തടസ്സങ്ങളെ മറികടക്കുകയും കപ്പാസിറ്റേഷന് വിധേയമാക്കുകയും ചെയ്യുന്ന തീവ്രമായ തിരഞ്ഞെടുപ്പ് പ്രക്രിയയുടെ വിജയിയാണ് ഈ ബീജം, ഇത് അവയുടെ ചലനാത്മകതയും ഉപരിതല ഘടകങ്ങളുടെ പ്രക്രിയയും വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നു.ബീജവും അണ്ഡാശയവും പരസ്പരം കണ്ടെത്തിയാലും, പ്രക്രിയ ഇതുവരെ അവസാനിച്ചിട്ടില്ല.ഓസൈറ്റിന് ചുറ്റും ക്യുമുലസ് കോശങ്ങളുടെ ഒരു പാളിയും സോണ പെല്ലുസിഡാ എന്ന ഗ്ലൈക്കോപ്രോട്ടീൻ തടസ്സവും ഉണ്ട്, അതിലൂടെ ബീജം കടന്നുപോകണം.ഈ അന്തിമ തടസ്സങ്ങളെ മറികടക്കാൻ ഉപരിതല അഡീഷൻ തന്മാത്രകളുടെയും സ്തരവുമായി ബന്ധപ്പെട്ടതും സ്രവിക്കുന്നതുമായ എൻസൈമുകളുടെ സംയോജനമാണ് ബീജസങ്കലനം ഉപയോഗിക്കുന്നത്.ഈ തന്മാത്രകളും എൻസൈമുകളും പ്രധാനമായും അകത്തെ മെംബ്രണിലും അക്രോസോമൽ മാട്രിക്സിലും സംഭരിക്കപ്പെടുകയും അക്രോസോമൽ പ്രതികരണ സമയത്ത് ബീജത്തിന്റെ പുറം മെംബ്രൺ ലൈസ് ചെയ്യുമ്പോൾ കണ്ടെത്തുകയും ചെയ്യുന്നു.ഈ തീവ്രമായ യാത്രയുടെ അവസാന ഘട്ടമാണ് ബീജ-മുട്ട സംയോജന പരിപാടി, അതിൽ രണ്ട് കോശങ്ങളും അവയുടെ ചർമ്മത്തെ സംയോജിപ്പിച്ച് ഒരൊറ്റ ഡിപ്ലോയിഡ് ഓർഗാനിസം ആയി മാറുന്നു.ഈ പ്രക്രിയ മനുഷ്യ പുനരുൽപാദനത്തിൽ തകർപ്പൻതാണെങ്കിലും, ആവശ്യമായ തന്മാത്രാ ഇടപെടലുകൾ മോശമായി മനസ്സിലാക്കപ്പെട്ടിട്ടില്ല.
ഗേമറ്റുകളുടെ ബീജസങ്കലനത്തിനു പുറമേ, രണ്ട് ലിപിഡ് ബൈലെയറുകളുടെ സംയോജനത്തിന്റെ രസതന്ത്രം വിപുലമായി പഠിച്ചിട്ടുണ്ട്.പൊതുവേ, മെംബ്രൻ ഫ്യൂഷൻ എന്നത് ഊർജ്ജസ്വലമായി പ്രതികൂലമായ ഒരു പ്രക്രിയയാണ്, രണ്ട് മെംബ്രണുകളെ പരസ്പരം അടുപ്പിക്കുകയും അവയുടെ തുടർച്ചയെ തകർക്കുകയും സംയോജനത്തിന് കാരണമാവുകയും ചെയ്യുന്ന ഘടനാപരമായ അനുരൂപീകരണ മാറ്റത്തിന് പ്രോട്ടീൻ കാറ്റലിസ്റ്റ് ആവശ്യമാണ്.ഈ പ്രോട്ടീൻ കാറ്റലിസ്റ്റുകൾ ഫ്യൂസോജനുകൾ എന്നറിയപ്പെടുന്നു, അവ എണ്ണമറ്റ ഫ്യൂഷൻ സിസ്റ്റങ്ങളിൽ കണ്ടെത്തിയിട്ടുണ്ട്.ആതിഥേയ കോശങ്ങളിലേക്കുള്ള വൈറൽ പ്രവേശനത്തിന് (ഉദാ, എച്ച്ഐവി-1 ലെ gp160, കൊറോണ വൈറസുകളിലെ സ്പൈക്ക്, ഇൻഫ്ലുവൻസ വൈറസുകളിലെ ഹെമാഗ്ലൂട്ടിനിൻ) 10,11,12 പ്ലാസന്റൽ (സിൻസിറ്റിൻ) 13,14,15, ലോവർ യൂക്കാരിയോട്ടുകളിൽ ഗമേറ്റ് രൂപപ്പെടുന്ന ഫ്യൂഷനുകൾ (ഉദാ. സസ്യങ്ങളിലും പ്രോട്ടിസ്റ്റുകളിലും ആർത്രോപോഡുകളിലും HAP2/GCS1) 16,17,18,19.മനുഷ്യ ഗേമറ്റുകൾക്കുള്ള ഫ്യൂസോജനുകൾ ഇതുവരെ കണ്ടെത്തിയിട്ടില്ല, എന്നിരുന്നാലും നിരവധി പ്രോട്ടീനുകൾ ഗെയിമറ്റ് അറ്റാച്ച്മെന്റിനും സംയോജനത്തിനും നിർണായകമാണെന്ന് തെളിയിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്.21,22,23, എലികളുടെയും മനുഷ്യ ഗേമറ്റുകളുടെയും സംയോജനത്തിന് ആവശ്യമായ ട്രാൻസ്മെംബ്രെൻ പ്രോട്ടീനായ ഓസൈറ്റ്-എക്സ്പ്രസ്ഡ് സിഡി 9 ആണ് ആദ്യമായി കണ്ടെത്തിയത്.അതിന്റെ കൃത്യമായ പ്രവർത്തനം വ്യക്തമല്ലെങ്കിലും, ബീജസങ്കലനത്തിൽ ഒരു പങ്ക്, മുട്ട മൈക്രോവില്ലിയിലെ അഡീഷൻ ഫോസിയുടെ ഘടന, കൂടാതെ/അല്ലെങ്കിൽ ഓസൈറ്റ് ഉപരിതല പ്രോട്ടീനുകളുടെ ശരിയായ പ്രാദേശികവൽക്കരണം എന്നിവ 24,25,26 ആണെന്ന് തോന്നുന്നു.ബീജ പ്രോട്ടീൻ IZUMO127 ഉം ഓസൈറ്റ് പ്രോട്ടീൻ JUNO28 ഉം ആണ് ഗെയിമറ്റ് ഫ്യൂഷനിൽ നിർണായകമായ രണ്ട് സാധാരണ പ്രോട്ടീനുകൾ, അവയുടെ പരസ്പര ബന്ധം സംയോജനത്തിന് മുമ്പുള്ള ഗേമറ്റ് തിരിച്ചറിയുന്നതിനും അഡീഷൻ ചെയ്യുന്നതിനുമുള്ള ഒരു പ്രധാന ഘട്ടമാണ്.ആൺ Izumo1 നോക്കൗട്ട് എലികളും പെൺ ജൂണോ നോക്കൗട്ട് എലികളും പൂർണ്ണമായും അണുവിമുക്തമാണ്, ഈ മോഡലുകളിൽ ബീജം പെരിവിറ്റലൈൻ സ്പേസിലേക്ക് പ്രവേശിക്കുന്നു, പക്ഷേ ഗെയിമറ്റുകൾ സംയോജിക്കുന്നില്ല.അതുപോലെ, ഹ്യൂമൻ ഇൻ വിട്രോ ഫെർട്ടിലൈസേഷൻ പരീക്ഷണങ്ങളിൽ ആന്റി-IZUMO1 അല്ലെങ്കിൽ JUNO27,29 ആന്റിബോഡികൾ ഉപയോഗിച്ച് ഗെയിമറ്റുകളെ ചികിത്സിച്ചപ്പോൾ സംഗമം കുറഞ്ഞു.
അടുത്തിടെ, IZUMO1, JUNO20,30,31,32,33,34,35 എന്നിവയ്‌ക്ക് സമാനമായ ബീനോടൈപ്പിക്-ആകർഷിച്ച പ്രോട്ടീനുകളുടെ ഒരു കൂട്ടം പുതുതായി കണ്ടെത്തിയിട്ടുണ്ട്.ബീജം അക്രോസോമൽ മെംബ്രൺ-അസോസിയേറ്റഡ് പ്രോട്ടീൻ 6 (SPACA6) ബീജസങ്കലനത്തിന് അത്യാവശ്യമാണെന്ന് ഒരു വലിയ തോതിലുള്ള മ്യൂറിൻ മ്യൂട്ടജെനിസിസ് പഠനത്തിൽ കണ്ടെത്തി.Spaca6 ജീനിലേക്ക് ട്രാൻസ്‌ജീനെ ചേർക്കുന്നത്, ഫ്യൂസിബിൾ അല്ലാത്ത ബീജം ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്നു, എന്നിരുന്നാലും ഈ ബീജങ്ങൾ പെരിവിറ്റെലൈൻ സ്‌പെയ്‌സിലേക്ക് നുഴഞ്ഞുകയറുന്നു.എലികളിലെ തുടർന്നുള്ള നോക്കൗട്ട് പഠനങ്ങൾ, ഗെയിമറ്റ് ഫ്യൂഷൻ 30,32 ന് Spaca6 ആവശ്യമാണെന്ന് സ്ഥിരീകരിച്ചു.SPACA6 ഏതാണ്ട് വൃഷണങ്ങളിൽ മാത്രം പ്രകടമാണ്, കൂടാതെ IZUMO1-ന് സമാനമായ ഒരു പ്രാദേശികവൽക്കരണ പാറ്റേൺ ഉണ്ട്, അതായത് അക്രോസോമൽ പ്രതികരണത്തിന് മുമ്പുള്ള ബീജസങ്കലനത്തിനുള്ളിൽ, തുടർന്ന് അക്രോസോമൽ പ്രതികരണം 30,32 ന് ശേഷം മധ്യരേഖാ പ്രദേശത്തേക്ക് മാറുന്നു.Spaca6 ഹോമോലോഗുകൾ പലതരം സസ്തനികളിലും മറ്റ് യൂക്കാരിയോട്ടുകളിലും ഉണ്ട്.IZUMO1, JUNO എന്നിവയിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമായി, SPACA6-ന്റെ ഘടന, ഇടപെടലുകൾ, പ്രവർത്തനം എന്നിവയുടെ വിശദാംശങ്ങൾ വ്യക്തമല്ല.
കുടുംബാസൂത്രണത്തിലും ഫെർട്ടിലിറ്റി ചികിത്സയിലും ഭാവിയിലെ സംഭവവികാസങ്ങൾ അറിയിക്കാൻ ഞങ്ങളെ പ്രാപ്തരാക്കുന്ന മനുഷ്യന്റെ ബീജത്തിന്റെയും അണ്ഡത്തിന്റെയും സംയോജനത്തിന് അടിവരയിടുന്ന അടിസ്ഥാന പ്രക്രിയയെ നന്നായി മനസ്സിലാക്കാൻ, ഞങ്ങൾ SPACA6 ഘടനാപരവും ജൈവ രാസപരവുമായ പഠനങ്ങൾ നടത്തി.SPACA6-ന്റെ എക്‌സ്‌ട്രാ സെല്ലുലാർ ഡൊമെയ്‌നിന്റെ ക്രിസ്റ്റൽ ഘടന ഒരു നാല്-ഹെലിക്കൽ ബണ്ടിലും (4HB) ഒരു ഇമ്യൂണോഗ്ലോബുലിൻ പോലെയുള്ള (Ig-പോലുള്ള) ഡൊമെയ്‌നും അർദ്ധ-ഫ്ലെക്‌സിബിൾ പ്രദേശങ്ങളാൽ ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു.മുൻ പഠനങ്ങളിൽ പ്രവചിച്ചതുപോലെ, 7,32,37, SPACA6 ന്റെ ഡൊമെയ്ൻ ഘടന മനുഷ്യ IZUMO1 ന്റെ ഘടനയ്ക്ക് സമാനമാണ്, കൂടാതെ രണ്ട് പ്രോട്ടീനുകളും അസാധാരണമായ ഒരു രൂപരേഖ പങ്കിടുന്നു: 4HB ഒരു ത്രികോണ ഹെലിക്കൽ പ്രതലവും ഒരു ജോടി ഡൈസൾഫൈഡ്-ലിങ്ക്ഡ് CXXC മോട്ടിഫുകളും.IZUMO1, SPACA6 എന്നിവ ഇപ്പോൾ ഗാമറ്റ് ഫ്യൂഷനുമായി ബന്ധപ്പെട്ട പ്രോട്ടീനുകളുടെ ഘടനാപരമായി ബന്ധപ്പെട്ട ഒരു വലിയ കുടുംബത്തെ നിർവചിക്കണമെന്ന് ഞങ്ങൾ നിർദ്ദേശിക്കുന്നു.സൂപ്പർ ഫാമിലിക്ക് സവിശേഷമായ ഫീച്ചറുകൾ ഉപയോഗിച്ച്, ഞങ്ങൾ ആൽഫഫോൾഡ് സ്ട്രക്ചറൽ ഹ്യൂമൻ പ്രോട്ടീമിനായി സമഗ്രമായ തിരച്ചിൽ നടത്തി, ഈ സൂപ്പർ ഫാമിലിയിലെ കൂടുതൽ അംഗങ്ങളെ തിരിച്ചറിഞ്ഞു, ഗെയിമറ്റ് ഫ്യൂഷൻ കൂടാതെ/അല്ലെങ്കിൽ ബീജസങ്കലനത്തിൽ ഏർപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന നിരവധി അംഗങ്ങളും ഉൾപ്പെടുന്നു.ഗെയിമറ്റ് ഫ്യൂഷനുമായി ബന്ധപ്പെട്ട പ്രോട്ടീനുകളുടെ ഒരു പൊതു ഘടനാപരമായ ഫോൾഡും സൂപ്പർ ഫാമിലിയും ഉണ്ടെന്ന് ഇപ്പോൾ ദൃശ്യമാകുന്നു, കൂടാതെ നമ്മുടെ ഘടന മനുഷ്യ ഗാമറ്റ് ഫ്യൂഷൻ മെക്കാനിസത്തിന്റെ ഈ പ്രധാന വശത്തിന്റെ തന്മാത്രാ മാപ്പ് നൽകുന്നു.
ഒരു എൻ-ലിങ്ക്ഡ് ഗ്ലൈക്കാനും ആറ് പുട്ടേറ്റീവ് ഡൈസൾഫൈഡ് ബോണ്ടുകളുമുള്ള ഒരു സിംഗിൾ-പാസ് ട്രാൻസ്മെംബ്രെൻ പ്രോട്ടീനാണ് SPACA6 (ചിത്രങ്ങൾ S1a, S2).ഡ്രോസോഫില എസ് 2 സെല്ലുകളിൽ ഹ്യൂമൻ SPACA6 (അവശിഷ്ടങ്ങൾ 27-246) ന്റെ എക്‌സ്‌ട്രാ സെല്ലുലാർ ഡൊമെയ്‌ൻ ഞങ്ങൾ പ്രകടിപ്പിക്കുകയും നിക്കൽ അഫിനിറ്റി, കാറ്റേഷൻ എക്‌സ്‌ചേഞ്ച്, സൈസ് എക്‌സ്‌ക്ലൂഷൻ ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി (ചിത്രം എസ് 1 ബി) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് പ്രോട്ടീൻ ശുദ്ധീകരിക്കുകയും ചെയ്തു.ശുദ്ധീകരിക്കപ്പെട്ട SPACA6 ectodomain വളരെ സ്ഥിരതയുള്ളതും ഏകതാനവുമാണ്.സൈസ് എക്‌സ്‌ക്ലൂഷൻ ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി ഉപയോഗിച്ചുള്ള വിശകലനം പോളിഗോണൽ ലൈറ്റ് സ്‌കാറ്ററിംഗുമായി (SEC-MALS) 26.2 ± 0.5 kDa (ചിത്രം S1c) കണക്കാക്കിയ തന്മാത്രാ ഭാരം ഉള്ള ഒരു കൊടുമുടി കണ്ടെത്തി.ഇത് SPACA6 മോണോമെറിക് എക്ടോഡോമൈനിന്റെ വലുപ്പവുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു, ഇത് ശുദ്ധീകരണ സമയത്ത് ഒളിഗോമറൈസേഷൻ സംഭവിച്ചിട്ടില്ലെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.കൂടാതെ, വൃത്താകൃതിയിലുള്ള ഡൈക്രോയിസം (സിഡി) സ്പെക്ട്രോസ്കോപ്പി 51.3 °C (ചിത്രം. S1d,e) ദ്രവണാങ്കം ഉള്ള ഒരു മിശ്രിത α/β ഘടന വെളിപ്പെടുത്തി.സിഡി സ്പെക്ട്രയുടെ ഡീകോൺവല്യൂഷൻ 38.6% α-ഹെലിക്കലും 15.8% β-സ്ട്രാൻഡഡ് മൂലകങ്ങളും വെളിപ്പെടുത്തി (ചിത്രം S1d).
റാൻഡം മാട്രിക്സ് സീഡിംഗ് 38 ഉപയോഗിച്ച് SPACA6 ectodomain ക്രിസ്റ്റലൈസ് ചെയ്തു, അതിന്റെ ഫലമായി 2.2 Å (പട്ടിക 1, ചിത്രം S3) റെസലൂഷൻ ഉള്ള ഒരു ഡാറ്റ സെറ്റ് ലഭിച്ചു.ഘടനാ നിർണ്ണയത്തിനായി ബ്രോമൈഡ് എക്സ്പോഷർ ഉള്ള ശകലം അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള മോളിക്യുലാർ സബ്സ്റ്റിറ്റ്യൂഷനും എസ്എഡി ഫേസിംഗ് ഡാറ്റയും (പട്ടിക 1, ചിത്രം എസ് 4) ഉപയോഗിച്ച്, അന്തിമ പരിഷ്കരിച്ച മാതൃകയിൽ അവശിഷ്ടങ്ങൾ 27-246 അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു.ഘടന നിർണ്ണയിച്ച സമയത്ത്, പരീക്ഷണാത്മക അല്ലെങ്കിൽ ആൽഫഫോൾഡ് ഘടനകളൊന്നും ലഭ്യമല്ല.SPACA6 ectodomain അളക്കുന്നത് 20 Å × 20 Å × 85 Å, ഏഴ് ഹെലിസുകളും ഒമ്പത് β-സ്ട്രാൻഡുകളും അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു, കൂടാതെ ആറ് ഡൈസൾഫൈഡ് ബോണ്ടുകളാൽ സ്ഥിരതയുള്ള നീളമേറിയ ത്രിതീയ ഫോൾഡുമുണ്ട് (ചിത്രം 1a, b).Asn243 സൈഡ് ചെയിനിന്റെ അവസാനത്തിലെ ദുർബലമായ ഇലക്ട്രോൺ സാന്ദ്രത ഈ അവശിഷ്ടം ഒരു N- ലിങ്ക്ഡ് ഗ്ലൈക്കോസൈലേഷൻ ആണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.ഘടനയിൽ രണ്ട് ഡൊമെയ്‌നുകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു: ഒരു N-ടെർമിനൽ ഫോർ-ഹെലിക്‌സ് ബണ്ടിൽ (4HB), അവയ്‌ക്കിടയിൽ ഒരു ഇന്റർമീഡിയറ്റ് ഹിഞ്ച് മേഖലയുള്ള ഒരു C-ടെർമിനൽ Ig-പോലുള്ള ഡൊമെയ്‌ൻ (ചിത്രം 1c).
SPACA6-ന്റെ എക്സ്ട്രാ സെല്ലുലാർ ഡൊമെയ്‌നിന്റെ ഒരു ഘടന.SPACA6-ന്റെ എക്സ്ട്രാ സെല്ലുലാർ ഡൊമെയ്‌നിന്റെ സ്ട്രിപ്പ് ഡയഗ്രം, N മുതൽ C-ടെർമിനസ് വരെയുള്ള ശൃംഖലയുടെ നിറം കടും നീല മുതൽ കടും ചുവപ്പ് വരെ.ഡൈസൾഫൈഡ് ബോണ്ടുകളിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന സിസ്റ്റൈനുകൾ മജന്തയിൽ ഹൈലൈറ്റ് ചെയ്യപ്പെടുന്നു.b SPACA6 ന്റെ എക്സ്ട്രാ സെല്ലുലാർ ഡൊമെയ്‌നിന്റെ ടോപ്പോളജി.ചിത്രം 1a-ലെ അതേ വർണ്ണ സ്കീം ഉപയോഗിക്കുക.c SPACA6 എക്സ്ട്രാ സെല്ലുലാർ ഡൊമെയ്ൻ.4HB, ഹിഞ്ച്, Ig-പോലുള്ള ഡൊമെയ്ൻ സ്ട്രിപ്പ് ചാർട്ടുകൾ യഥാക്രമം ഓറഞ്ച്, പച്ച, നീല എന്നീ നിറങ്ങളിലുള്ളതാണ്.പാളികൾ സ്കെയിലിലേക്ക് വരച്ചിട്ടില്ല.
SPACA6-ന്റെ 4HB ഡൊമെയ്‌നിൽ നാല് പ്രധാന ഹെലിസുകൾ (ഹെലിസുകൾ 1-4) ഉൾപ്പെടുന്നു, അവ ഒരു ഹെലിക്‌സ് ഹെലിക്‌സ് (ചിത്രം 2a) രൂപത്തിൽ ക്രമീകരിച്ചിരിക്കുന്നു, ആന്റിപാരലൽ, പാരലൽ ഇന്ററാക്ഷനുകൾക്കിടയിൽ ഒന്നിടവിട്ട് (ചിത്രം 2 ബി).ഒരു ചെറിയ അധിക സിംഗിൾ-ടേൺ ഹെലിക്സ് (ഹെലിക്സ് 1′) ബണ്ടിലിന് ലംബമായി സ്ഥാപിച്ചിരിക്കുന്നു, 1, 2 എന്നീ ഹെലിസുകളുള്ള ഒരു ത്രികോണം രൂപംകൊള്ളുന്നു. 3, 4 എന്നീ ഹെലിസുകളുടെ താരതമ്യേന സാന്ദ്രമായ പാക്കിംഗിൽ ഈ ത്രികോണം ചെറുതായി രൂപഭേദം വരുത്തിയിരിക്കുന്നു. ചിത്രം 2a).
4HB N-ടെർമിനൽ സ്ട്രിപ്പ് ചാർട്ട്.b നാല് ഹെലിസുകളുടെ ഒരു ബണ്ടിലിന്റെ മുകളിലെ കാഴ്ച, ഓരോ ഹെലിക്‌സും N-ടെർമിനസിൽ കടും നീലയിലും C-ടെർമിനസിൽ കടും ചുവപ്പിലും ഹൈലൈറ്റ് ചെയ്‌തിരിക്കുന്നു.c 4HB-നുള്ള ടോപ്പ്-ഡൌൺ സ്‌പൈറൽ വീൽ ഡയഗ്രം, ഓരോ അവശിഷ്ടവും ഒറ്റ-അക്ഷരമുള്ള അമിനോ ആസിഡ് കോഡ് ഉപയോഗിച്ച് ലേബൽ ചെയ്‌ത ഒരു സർക്കിളായി കാണിക്കുന്നു;ചക്രത്തിന്റെ മുകളിലുള്ള നാല് അമിനോ ആസിഡുകൾ മാത്രമേ അക്കമിട്ടിട്ടുള്ളൂ.നോൺ-പോളാർ അവശിഷ്ടങ്ങൾക്ക് മഞ്ഞ നിറവും, ധ്രുവീയ ചാർജ് ചെയ്യാത്ത അവശിഷ്ടങ്ങൾക്ക് പച്ച നിറവും, പോസിറ്റീവ് ചാർജുള്ള അവശിഷ്ടങ്ങൾക്ക് നീല നിറവും, നെഗറ്റീവ് ചാർജുള്ള അവശിഷ്ടങ്ങൾക്ക് ചുവപ്പും നിറമുണ്ട്.d 4HB ഡൊമെയ്‌നിന്റെ ത്രികോണ മുഖങ്ങൾ, 4HBകൾ ഓറഞ്ചിലും ഹിംഗുകൾ പച്ചയിലും.രണ്ട് ഇൻസെറ്റുകളും വടിയുടെ ആകൃതിയിലുള്ള ഡൈസൾഫൈഡ് ബോണ്ടുകൾ കാണിക്കുന്നു.
4HB പ്രധാനമായും അലിഫാറ്റിക്, ആരോമാറ്റിക് അവശിഷ്ടങ്ങൾ (ചിത്രം 2c) അടങ്ങിയ ഒരു ആന്തരിക ഹൈഡ്രോഫോബിക് കോറിൽ കേന്ദ്രീകരിച്ചിരിക്കുന്നു.കാമ്പിൽ Cys41-നും Cys55-നും ഇടയിലുള്ള ഒരു ഡൈസൾഫൈഡ് ബോണ്ട് അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു, അത് മുകളിൽ ഉയർത്തിയിരിക്കുന്ന ഒരു ത്രികോണത്തിൽ ഹെലിസുകൾ 1 ഉം 2 ഉം തമ്മിൽ ബന്ധിപ്പിക്കുന്നു (ചിത്രം 2d).ഹെലിക്സ് 1′-ലെ CXXC മോട്ടിഫും ഹിഞ്ച് മേഖലയിലെ β-ഹെയർപിന്നിന്റെ അഗ്രഭാഗത്ത് കണ്ടെത്തിയ മറ്റൊരു CXXC മോട്ടിഫും തമ്മിൽ രണ്ട് അധിക ഡൈസൾഫൈഡ് ബോണ്ടുകൾ രൂപീകരിച്ചു (ചിത്രം 2d).ഒരു അജ്ഞാത പ്രവർത്തനമുള്ള (Arg37) ഒരു യാഥാസ്ഥിതിക അർജിനൈൻ അവശിഷ്ടം 1′, 1, 2 എന്നീ ഹെലിസുകളാൽ രൂപംകൊണ്ട ഒരു പൊള്ളയായ ത്രികോണത്തിനുള്ളിലാണ് സ്ഥിതി ചെയ്യുന്നത്. അലിഫാറ്റിക് കാർബൺ ആറ്റങ്ങൾ Cβ, Cγ, Cδ Arg37 ഹൈഡ്രോഫോബിക് കോറുമായി ഇടപഴകുകയും അതിന്റെ ഗ്വാനിഡൈൻ ഗ്രൂപ്പുകൾ ചാക്രികമായി ചലിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു. Thr32 ബാക്ക്‌ബോണും സൈഡ് ചെയിനും (ചിത്രം S5a,b) തമ്മിലുള്ള ഇടപെടലുകൾ വഴി 1′, 1 ഹെലിസുകൾക്കിടയിൽ.Tyr34 രണ്ട് ചെറിയ അറകൾ ഉപേക്ഷിച്ച് അറയിലേക്ക് വ്യാപിക്കുന്നു, അതിലൂടെ Arg37 ലായകവുമായി സംവദിക്കാൻ കഴിയും.
ഒരു ഹൈഡ്രോഫോബിക് കോർ വഴി സംവദിക്കുന്ന രണ്ടോ അതിലധികമോ മൾട്ടി-സ്ട്രാൻഡഡ് ആംഫിപതിക് β-ഷീറ്റുകളുടെ പൊതുവായ സവിശേഷത പങ്കിടുന്ന പ്രോട്ടീനുകളുടെ ഒരു വലിയ സൂപ്പർ ഫാമിലിയാണ് Ig-പോലുള്ള β-സാൻഡ്‌വിച്ച് ഡൊമെയ്‌നുകൾ. SPACA6-ന്റെ C-ടെർമിനൽ Ig-പോലുള്ള ഡൊമെയ്‌നും ഇതേ പാറ്റേൺ ഉണ്ട്. കൂടാതെ രണ്ട് പാളികൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു (ചിത്രം. S6a).ഷീറ്റ് 1 എന്നത് നാല് സ്ട്രോണ്ടുകളുടെ (ഡി, എഫ്, എച്ച്, ഐ എന്നീ സ്ട്രാൻഡുകളുടെ) β-ഷീറ്റാണ്, അവിടെ സ്ട്രോണ്ടുകൾ എഫ്, എച്ച്, ഐ എന്നിവ ഒരു ആന്റി-പാരലൽ ക്രമീകരണം ഉണ്ടാക്കുന്നു, ഒപ്പം ഐ, ഡി എന്നിവ സമാന്തരമായി ഇടപെടുകയും ചെയ്യുന്നു.ടേബിൾ 2 ഒരു ചെറിയ ആന്റി-പാരലൽ ഡബിൾ-സ്ട്രാൻഡഡ് ബീറ്റാ ഷീറ്റാണ് (സ്ട്രാൻഡുകൾ ഇ, ജി).E ശൃംഖലയുടെ C-ടെർമിനസിനും H ചെയിനിന്റെ മധ്യഭാഗത്തും (Cys170-Cys226) ഒരു ആന്തരിക ഡൈസൾഫൈഡ് ബോണ്ട് നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു (ചിത്രം. S6b).ഇമ്യൂണോഗ്ലോബുലിൻ 40,41 ന്റെ β-സാൻഡ്‌വിച്ച് ഡൊമെയ്‌നിലെ ഡിസൾഫൈഡ് ബോണ്ടിനോട് സാമ്യമുള്ളതാണ് ഈ ഡൈസൾഫൈഡ് ബോണ്ട്.
ഫോർ-സ്ട്രാൻഡ് β-ഷീറ്റ് അതിന്റെ മുഴുവൻ നീളത്തിലും വളച്ചൊടിക്കുന്നു, ആകൃതിയിലും ഇലക്ട്രോസ്റ്റാറ്റിക്സിലും വ്യത്യാസമുള്ള അസമമായ അരികുകൾ ഉണ്ടാക്കുന്നു.SPACA6 (ചിത്രം. S6b,c) ലെ ശേഷിക്കുന്ന അസമത്വവും ഇലക്‌ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് വൈവിദ്ധ്യമുള്ളതുമായ പ്രതലങ്ങളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ വേറിട്ടുനിൽക്കുന്ന ഒരു പരന്ന ഹൈഡ്രോഫോബിക് പാരിസ്ഥിതിക പ്രതലമാണ് കനം കുറഞ്ഞ അഗ്രം.ഹൈഡ്രോഫോബിക് പ്രതലത്തെ വലയം ചെയ്യുന്ന നട്ടെല്ലുള്ള കാർബണിൽ/അമിനോ ഗ്രൂപ്പുകളുടെയും പോളാർ സൈഡ് ചെയിനുകളുടെയും ഒരു വലയം (ചിത്രം. S6c).ഹൈഡ്രോഫോബിക് കോറിന്റെ എൻ-ടെർമിനൽ ഭാഗത്തെ തടയുകയും എഫ് ചെയിൻ ബാക്ക്‌ബോണിന്റെ (ചിത്രം. S6d) തുറന്ന ധ്രുവഗ്രൂപ്പുമായി മൂന്ന് ഹൈഡ്രജൻ ബോണ്ടുകൾ രൂപപ്പെടുത്തുകയും ചെയ്യുന്ന ഒരു ക്യാപ്ഡ് ഹെലിക്‌സ് സെഗ്‌മെന്റാണ് വിശാലമായ മാർജിൻ മൂടിയിരിക്കുന്നത്.ഈ അരികിലെ സി-ടെർമിനൽ ഭാഗം ഭാഗികമായി തുറന്നിരിക്കുന്ന ഹൈഡ്രോഫോബിക് കോർ ഉള്ള ഒരു വലിയ പോക്കറ്റ് ഉണ്ടാക്കുന്നു.മൂന്ന് സെറ്റ് ഇരട്ട അർജിനൈൻ അവശിഷ്ടങ്ങൾ (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205, Arg212-Arg214), ഒരു സെൻട്രൽ ഹിസ്‌റ്റിഡിൻ (His220) (ചിത്രം S6e) എന്നിവ കാരണം പോക്കറ്റിന് ചുറ്റും പോസിറ്റീവ് ചാർജുകൾ ഉണ്ട്.
ഹെലിക്കൽ ഡൊമെയ്‌നും Ig-പോലുള്ള ഡൊമെയ്‌നും ഇടയിലുള്ള ഒരു ചെറിയ സെഗ്‌മെന്റാണ് ഹിഞ്ച് റീജിയൻ, അതിൽ ഒരു ആന്റിപാരലൽ ത്രീ-സ്ട്രാൻഡഡ് β-ലെയർ (സ്ട്രാൻഡ്‌സ് എ, ബി, സി), ഒരു ചെറിയ 310 ഹെലിക്‌സ്, നിരവധി നീണ്ട റാൻഡം ഹെലിക്‌സ് സെഗ്‌മെന്റുകൾ എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു.(ചിത്രം S7).ഹിഞ്ച് മേഖലയിലെ കോവാലന്റ്, ഇലക്‌ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് കോൺടാക്‌റ്റുകളുടെ ഒരു ശൃംഖല 4HB-നും Ig-പോലുള്ള ഡൊമെയ്‌നിനും ഇടയിലുള്ള ഓറിയന്റേഷൻ സ്ഥിരപ്പെടുത്തുന്നതായി തോന്നുന്നു.ശൃംഖലയെ മൂന്ന് ഭാഗങ്ങളായി തിരിക്കാം.ആദ്യ ഭാഗത്തിൽ രണ്ട് CXXC മോട്ടിഫുകൾ (27CXXC30, 139CXXC142) ഉൾപ്പെടുന്നു, അത് ഹിഞ്ചിലെ β-ഹെയർപിനും 4HB-യിലെ 1′ ഹെലിക്സും തമ്മിൽ ഒരു ജോടി ഡൈസൾഫൈഡ് ബോണ്ടുകൾ ഉണ്ടാക്കുന്നു.രണ്ടാം ഭാഗത്തിൽ Ig-പോലുള്ള ഡൊമെയ്‌നും ഹിംഗും തമ്മിലുള്ള ഇലക്‌ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് ഇടപെടലുകൾ ഉൾപ്പെടുന്നു.ഹിംഗിലെ Glu132, Ig ​​പോലുള്ള ഡൊമെയ്‌നിൽ Arg233 ഉം ഹിംഗിൽ Arg135 ഉം ഉള്ള ഒരു ഉപ്പ് പാലം ഉണ്ടാക്കുന്നു.മൂന്നാം ഭാഗത്തിൽ Ig പോലുള്ള ഡൊമെയ്‌നും ഹിഞ്ച് മേഖലയും തമ്മിലുള്ള ഒരു കോവാലന്റ് ബോണ്ട് ഉൾപ്പെടുന്നു.രണ്ട് ഡൈസൾഫൈഡ് ബോണ്ടുകൾ (Cys124-Cys147, Cys128-Cys153) Gln131-നും ബാക്ക്‌ബോൺ ഫംഗ്‌ഷണൽ ഗ്രൂപ്പിനും ഇടയിലുള്ള ഇലക്‌ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് ഇന്ററാക്ഷനിലൂടെ സ്ഥിരത കൈവരിക്കുന്ന ഒരു ലിങ്കറുമായി ഹിഞ്ച് ലൂപ്പിനെ ബന്ധിപ്പിക്കുന്നു, ഇത് ആദ്യത്തെ Ig-പോലുള്ള ഡൊമെയ്‌നിലേക്ക് പ്രവേശനം അനുവദിക്കുന്നു.ചങ്ങല.
SPACA6 ectodomain ന്റെ ഘടനയും 4HB, Ig-പോലുള്ള ഡൊമെയ്‌നുകളുടെ വ്യക്തിഗത ഘടനകളും പ്രോട്ടീൻ ഡാറ്റാബേസുകളിൽ ഘടനാപരമായി സമാനമായ രേഖകൾക്കായി തിരയാൻ ഉപയോഗിച്ചു 42 .ഉയർന്ന ഡാലി Z സ്‌കോറുകൾ, ചെറിയ സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷനുകൾ, വലിയ LALI സ്‌കോറുകൾ എന്നിവയുള്ള പൊരുത്തങ്ങൾ ഞങ്ങൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞു (രണ്ടാമത്തേത് ഘടനാപരമായി തുല്യമായ അവശിഷ്ടങ്ങളുടെ എണ്ണമാണ്).ഫുൾ എക്ടോഡോമെയ്‌ൻ സെർച്ചിൽ (ടേബിൾ എസ് 1) നിന്നുള്ള ആദ്യത്തെ 10 ഹിറ്റുകൾക്ക് സ്വീകാര്യമായ ഇസഡ് സ്‌കോർ> 842 ആണെങ്കിലും, 4HB അല്ലെങ്കിൽ Ig-പോലുള്ള ഡൊമെയ്‌നിനായുള്ള തിരയൽ മാത്രം കാണിക്കുന്നത് ഈ ഹിറ്റുകളിൽ ഭൂരിഭാഗവും β-സാൻഡ്‌വിച്ചുകളുമായി മാത്രം ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു എന്നാണ്.പല പ്രോട്ടീനുകളിലും കാണപ്പെടുന്ന ഒരു സർവ്വവ്യാപിയായ ഫോൾഡ്.ഡാലിയിലെ മൂന്ന് തിരയലുകളും ഒരു ഫലം മാത്രമാണ് നൽകിയത്: IZUMO1.
SPACA6 ഉം IZUMO1 ഉം ഘടനാപരമായ സമാനതകൾ 7,32,37 പങ്കിടുന്നുവെന്ന് വളരെക്കാലമായി നിർദ്ദേശിക്കപ്പെട്ടിരുന്നു.ഈ രണ്ട് ഗെയിമറ്റ് ഫ്യൂഷൻ-അസോസിയേറ്റഡ് പ്രോട്ടീനുകളുടെ എക്ടോഡോമെയ്‌നുകൾ 21% സീക്വൻസ് ഐഡന്റിറ്റി (ചിത്രം S8a) പങ്കിടുന്നുണ്ടെങ്കിലും, സംരക്ഷിത ഡൈസൾഫൈഡ് ബോണ്ട് പാറ്റേണും SPACA6-ൽ പ്രവചിക്കപ്പെട്ട C-ടെർമിനൽ Ig-പോലുള്ള ഡൊമെയ്‌നും ഉൾപ്പെടെയുള്ള സങ്കീർണ്ണമായ തെളിവുകൾ, ഒരു നിർമ്മാണത്തിനുള്ള ആദ്യകാല ശ്രമങ്ങളെ അനുവദിച്ചു. IZUMO1 ഒരു ടെംപ്ലേറ്റായി ഉപയോഗിക്കുന്ന A a SPACA6 മൗസിന്റെ ഹോമോളജി മോഡൽ37.ഞങ്ങളുടെ ഘടന ഈ പ്രവചനങ്ങളെ സ്ഥിരീകരിക്കുകയും സമാനതയുടെ യഥാർത്ഥ അളവ് കാണിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.വാസ്തവത്തിൽ, SPACA6, IZUMO137,43,44 ഘടനകൾ ഒരേ രണ്ട്-ഡൊമെയ്ൻ ആർക്കിടെക്ചർ (ചിത്രം S8b) പങ്കിടുന്നു, സമാനമായ 4HB, Ig-പോലുള്ള β-സാൻഡ്‌വിച്ച് ഡൊമെയ്‌നുകൾ ഒരു ഹിഞ്ച് മേഖലയുമായി ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു (ചിത്രം. S8c).
IZUMO1, SPACA6 4HB എന്നിവയ്ക്ക് പരമ്പരാഗത സർപ്പിള ബണ്ടിലുകളിൽ നിന്ന് പൊതുവായ വ്യത്യാസങ്ങളുണ്ട്.എൻഡോസോമൽ ഫ്യൂഷൻ 45,46-ൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന SNARE പ്രോട്ടീൻ കോംപ്ലക്സുകളിൽ കാണപ്പെടുന്നത് പോലെ സാധാരണ 4HB-കൾക്ക് ഒരു കേന്ദ്ര അക്ഷത്തിന് ചുറ്റും സ്ഥിരമായ വക്രത നിലനിർത്തുന്ന തുല്യ അകലത്തിലുള്ള ഹെലിസുകൾ ഉണ്ട് 47. ഇതിനു വിപരീതമായി, IZUMO1, SPACA6 എന്നിവയിലെ ഹെലിക്കൽ ഡൊമെയ്‌നുകൾ വികലമായി, വേരിയബിൾ വക്രതയും അസമമായ പാക്കിംഗ് (ചിത്രം S8d).1′, 1, 2 ഹെലിസുകളാൽ രൂപപ്പെട്ട ത്രികോണം മൂലമുണ്ടാകുന്ന ട്വിസ്റ്റ്, IZUMO1, SPACA6 എന്നിവയിൽ നിലനിർത്തുകയും ഹെലിക്സ് 1′-ലെ അതേ CXXC മോട്ടിഫ് ഉപയോഗിച്ച് സ്ഥിരപ്പെടുത്തുകയും ചെയ്യുന്നു.എന്നിരുന്നാലും, SPACA6-ൽ കാണപ്പെടുന്ന അധിക ഡൈസൾഫൈഡ് ബോണ്ട് (Cys41 ഉം Cys55 ഉം ഹെലിസുകളെ 1, 2 എന്നിവയെ ബന്ധിപ്പിക്കുന്നു) ത്രികോണാഗ്രത്തിൽ മൂർച്ചയുള്ള അഗ്രം സൃഷ്ടിക്കുന്നു, SPACA6-നെ IZUMO1 നേക്കാൾ വളച്ചൊടിക്കുന്നു, കൂടുതൽ വ്യക്തമായ അറ ത്രികോണങ്ങളോടെ.കൂടാതെ, SPACA6-ൽ ഈ അറയുടെ മധ്യഭാഗത്ത് നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ട Arg37 ന്റെ അഭാവം IZUMO1 ആണ്.ഇതിനു വിപരീതമായി, IZUMO1 ന് അലിഫാറ്റിക്, ആരോമാറ്റിക് അവശിഷ്ടങ്ങളുടെ കൂടുതൽ സാധാരണ ഹൈഡ്രോഫോബിക് കോർ ഉണ്ട്.
IZUMO1 ന് ഇരട്ട സ്‌ട്രാൻഡഡ്, അഞ്ച് സ്‌ട്രാൻഡഡ് β-ഷീറ്റ് 43 അടങ്ങുന്ന ഒരു Ig പോലുള്ള ഡൊമെയ്‌ൻ ഉണ്ട്.IZUMO1-ലെ അധിക സ്ട്രാൻഡ് SPACA6-ലെ കോയിലിനെ മാറ്റിസ്ഥാപിക്കുന്നു, ഇത് സ്‌ട്രാൻഡിലെ നട്ടെല്ലുള്ള ഹൈഡ്രജൻ ബോണ്ടുകളെ പരിമിതപ്പെടുത്താൻ F സ്‌ട്രാൻഡുമായി സംവദിക്കുന്നു.രണ്ട് പ്രോട്ടീനുകളുടെ Ig-പോലുള്ള ഡൊമെയ്‌നുകളുടെ പ്രവചിക്കപ്പെട്ട ഉപരിതല ചാർജാണ് താരതമ്യത്തിന്റെ രസകരമായ ഒരു പോയിന്റ്.IZUMO1 ഉപരിതലം SPACA6 പ്രതലത്തേക്കാൾ നെഗറ്റീവ് ചാർജ്ജാണ്.ബീജ സ്തരത്തിന് അഭിമുഖമായി സി-ടെർമിനസിന് സമീപം ഒരു അധിക ചാർജ് സ്ഥിതിചെയ്യുന്നു.SPACA6-ൽ, അതേ പ്രദേശങ്ങൾ കൂടുതൽ നിഷ്പക്ഷമോ പോസിറ്റീവ് ചാർജുള്ളതോ ആയിരുന്നു (ചിത്രം. S8e).ഉദാഹരണത്തിന്, SPACA6-ലെ ഹൈഡ്രോഫോബിക് ഉപരിതലവും (നേർത്ത അരികുകളും) പോസിറ്റീവ് ചാർജുള്ള കുഴികളും (വിശാലമായ അരികുകൾ) IZUMO1-ൽ നെഗറ്റീവ് ചാർജ്ജ് ചെയ്യുന്നു.
IZUMO1 ഉം SPACA6 ഉം തമ്മിലുള്ള ബന്ധവും ദ്വിതീയ ഘടന ഘടകങ്ങളും നന്നായി സംരക്ഷിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെങ്കിലും, Ig-പോലുള്ള ഡൊമെയ്‌നുകളുടെ ഘടനാപരമായ വിന്യാസം രണ്ട് ഡൊമെയ്‌നുകളും അവയുടെ പൊതുവായ ഓറിയന്റേഷനിൽ പരസ്പരം ആപേക്ഷികമായി വ്യത്യാസപ്പെട്ടിരിക്കുന്നുവെന്ന് കാണിക്കുന്നു (ചിത്രം. S9).IZUMO1 ന്റെ സർപ്പിള ബണ്ടിൽ β-സാൻഡ്‌വിച്ചിന് ചുറ്റും വളഞ്ഞതാണ്, മുമ്പ് വിവരിച്ച "ബൂമറാംഗ്" ആകൃതി കേന്ദ്ര അക്ഷത്തിൽ നിന്ന് ഏകദേശം 50 ഡിഗ്രിയിൽ സൃഷ്ടിക്കുന്നു.വിപരീതമായി, SPACA6 ലെ ഹെലിക്‌സ് ബീം എതിർദിശയിൽ ഏകദേശം 10° ചരിഞ്ഞു.ഈ ഓറിയന്റേഷനുകളിലെ വ്യത്യാസങ്ങൾ ഹിഞ്ച് മേഖലയിലെ വ്യത്യാസങ്ങൾ മൂലമാകാം.പ്രൈമറി സീക്വൻസ് തലത്തിൽ, IZUMO1, SPACA6 എന്നിവ ഹിംഗിൽ ചെറിയ സീക്വൻസ് സമാനത പങ്കിടുന്നു, സിസ്റ്റൈൻ, ഗ്ലൈസിൻ, അസ്പാർട്ടിക് ആസിഡ് അവശിഷ്ടങ്ങൾ എന്നിവ ഒഴികെ.തൽഫലമായി, ഹൈഡ്രജൻ ബോണ്ടുകളും ഇലക്ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് നെറ്റ്‌വർക്കുകളും തികച്ചും വ്യത്യസ്തമാണ്.β-ഷീറ്റ് ദ്വിതീയ ഘടന ഘടകങ്ങൾ IZUMO1, SPACA6 എന്നിവ പങ്കിടുന്നു, എന്നിരുന്നാലും IZUMO1 ലെ ശൃംഖലകൾ വളരെ ദൈർഘ്യമേറിയതും 310 ഹെലിക്സ് (ഹെലിക്സ് 5) SPACA6 ന്റെ അദ്വിതീയവുമാണ്.ഈ വ്യത്യാസങ്ങൾ സമാനമായ രണ്ട് പ്രോട്ടീനുകൾക്ക് വ്യത്യസ്ത ഡൊമെയ്ൻ ഓറിയന്റേഷനിൽ കലാശിക്കുന്നു.
ഈ പ്രത്യേക 4HB ഫോൾഡ് (പട്ടിക S1) ഉള്ള പ്രോട്ടീൻ ഡാറ്റാബേസിൽ സംഭരിച്ചിരിക്കുന്ന പരീക്ഷണാത്മകമായി നിർണ്ണയിക്കപ്പെട്ട രണ്ട് ഘടനകൾ മാത്രമാണ് SPACA6 ഉം IZUMO1 ഉം എന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഡാലി സെർവർ തിരയൽ വെളിപ്പെടുത്തി.അടുത്തിടെ, DeepMind (ആൽഫബെറ്റ്/ഗൂഗിൾ) ആൽഫഫോൾഡ് വികസിപ്പിച്ചെടുത്തിട്ടുണ്ട്, ഇത് പ്രാഥമിക ശ്രേണികളിൽ നിന്ന് പ്രോട്ടീനുകളുടെ 3D ഘടനകളെ കൃത്യമായി പ്രവചിക്കാൻ കഴിയുന്ന ന്യൂറൽ നെറ്റ്‌വർക്ക് അധിഷ്ഠിത സംവിധാനമാണ്.ഞങ്ങൾ SPACA6 ഘടന പരിഹരിച്ചതിന് തൊട്ടുപിന്നാലെ, ആൽഫഫോൾഡ് ഡാറ്റാബേസ് പുറത്തിറങ്ങി, മനുഷ്യ പ്രോട്ടീമിലെ എല്ലാ പ്രോട്ടീനുകളുടെയും 98.5% ഉൾക്കൊള്ളുന്ന പ്രവചന ഘടന മോഡലുകൾ നൽകുന്നു.ഞങ്ങളുടെ പരിഹരിച്ച SPACA6 ഘടനയെ ഒരു തിരയൽ മോഡലായി ഉപയോഗിച്ച്, ആൽഫഫോൾഡ് ഹ്യൂമൻ പ്രോട്ടിയോമിലെ മോഡലിനായുള്ള ഒരു ഘടനാപരമായ ഹോമോളജി തിരയൽ, SPACA6, IZUMO1 എന്നിവയുമായി സാധ്യമായ ഘടനാപരമായ സാമ്യമുള്ള ഉദ്യോഗാർത്ഥികളെ തിരിച്ചറിഞ്ഞു.SPACA6 (ചിത്രം S10a) പ്രവചിക്കുന്നതിൽ AlphaFold-ന്റെ അവിശ്വസനീയമായ കൃത്യത കണക്കിലെടുക്കുമ്പോൾ-പ്രത്യേകിച്ച് 1.1 Å rms ectodomain ഞങ്ങളുടെ പരിഹരിച്ച ഘടനയുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ (ചിത്രം. S10b) - തിരിച്ചറിഞ്ഞ SPACA6 പൊരുത്തങ്ങൾ കൃത്യമാകാൻ സാധ്യതയുണ്ടെന്ന് ഞങ്ങൾക്ക് ഉറപ്പിക്കാം.
മുമ്പ്, PSI-BLAST മറ്റ് മൂന്ന് ബീജങ്ങളുമായി ബന്ധപ്പെട്ട IZUMO1 ക്ലസ്റ്ററിനായി തിരഞ്ഞു: IZUMO2, IZUMO3, IZUMO450.ഈ IZUMO ഫാമിലി പ്രോട്ടീനുകൾ IZUMO1 (ചിത്രങ്ങൾ 3a, S11) പോലെയുള്ള അതേ ഡൈസൾഫൈഡ് ബോണ്ട് പാറ്റേൺ ഉപയോഗിച്ച് 4HB ഡൊമെയ്‌നിലേക്ക് മടക്കിക്കളയുമെന്ന് ആൽഫഫോൾഡ് പ്രവചിച്ചു, അവയ്ക്ക് Ig-പോലുള്ള ഡൊമെയ്‌ൻ ഇല്ലെങ്കിലും.IZUMO2, IZUMO3 എന്നിവ IZUMO1-ന് സമാനമായ ഏകപക്ഷീയമായ മെംബ്രൻ പ്രോട്ടീനുകളാണെന്ന് അനുമാനിക്കപ്പെടുന്നു, അതേസമയം IZUMO4 സ്രവിക്കുന്നതായി കാണപ്പെടുന്നു.ഗെയിംറ്റ് ഫ്യൂഷനിലെ IZUMO 2, 3, 4 പ്രോട്ടീനുകളുടെ പ്രവർത്തനങ്ങൾ നിർണ്ണയിച്ചിട്ടില്ല.ശുക്ലവികസന സമയത്ത് IZUMO3 അക്രോസോം ബയോജെനിസിസിൽ ഒരു പങ്ക് വഹിക്കുന്നു.സസ്തനികൾ, ഉരഗങ്ങൾ, ഉഭയജീവികൾ എന്നിവയിലെ IZUMO പ്രോട്ടീനുകളുടെ സംരക്ഷണം സൂചിപ്പിക്കുന്നത് അവയുടെ സാധ്യതയുള്ള പ്രവർത്തനം DCST1/2, SOF1, FIMP പോലുള്ള മറ്റ് അറിയപ്പെടുന്ന ഗെയിമറ്റ്-ഫ്യൂഷൻ-അസോസിയേറ്റഡ് പ്രോട്ടീനുകളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു എന്നാണ്.
4HB, ഹിഞ്ച്, Ig-പോലുള്ള ഡൊമെയ്‌നുകൾ എന്നിവ യഥാക്രമം ഓറഞ്ച്, പച്ച, നീല എന്നിവയിൽ ഹൈലൈറ്റ് ചെയ്‌തിരിക്കുന്ന IST സൂപ്പർ ഫാമിലിയുടെ ഡൊമെയ്‌ൻ ആർക്കിടെക്‌ചറിന്റെ ഡയഗ്രം.IZUMO4 ന് കറുത്തതായി തോന്നുന്ന ഒരു അദ്വിതീയ സി-ടെർമിനൽ മേഖലയുണ്ട്.യഥാക്രമം സോളിഡ്, ഡോട്ടഡ് ലൈനുകളാൽ സ്ഥിരീകരിക്കപ്പെട്ടതും രൂപപ്പെടുത്തുന്നതുമായ ഡൈസൾഫൈഡ് ബോണ്ടുകൾ കാണിക്കുന്നു.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (ആൽഫഫോൾഡ് DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (ആൽഫഫോൾഡ് DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (ആൽഫഫോൾഡ് DB: AF-Q1ZYLF5), കൂടാതെ DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) പാനൽ A പോലെ അതേ വർണ്ണ ശ്രേണിയിൽ പ്രദർശിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു. ഡിസൾഫൈഡ് ബോണ്ടുകൾ മജന്തയിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.TMEM95, IZUMO2, IZUMO3 ട്രാൻസ്മെംബ്രെൻ ഹെലിസുകൾ കാണിച്ചിട്ടില്ല.
IZUMO പ്രോട്ടീനിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമായി, മറ്റ് SPACA പ്രോട്ടീനുകൾ (അതായത്, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5, SPACA9) SPACA6 (ചിത്രം S12) ൽ നിന്ന് ഘടനാപരമായി വ്യത്യസ്തമാണെന്ന് കരുതപ്പെടുന്നു.SPACA9-ന് മാത്രമേ 4HB ഉള്ളൂ, എന്നാൽ ഇതിന് SPACA6-ന്റെ അതേ സമാന്തര-ആന്റി-പാരലൽ ഓറിയന്റേഷനോ അതേ ഡൈസൾഫൈഡ് ബോണ്ടോ ഉണ്ടായിരിക്കുമെന്ന് പ്രതീക്ഷിക്കുന്നില്ല.SPACA1-ന് മാത്രമേ സമാനമായ Ig-പോലുള്ള ഡൊമെയ്‌നുള്ളൂ.SPACA3, SPACA4, SPACA5 എന്നിവയ്ക്ക് SPACA6 നേക്കാൾ തികച്ചും വ്യത്യസ്തമായ ഘടനയുണ്ടെന്ന് ആൽഫഫോൾഡ് പ്രവചിക്കുന്നു.രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, ബീജസങ്കലനത്തിൽ SPACA4 ഒരു പങ്ക് വഹിക്കുന്നുണ്ട്, എന്നാൽ SPACA6 നേക്കാൾ വലിയ അളവിൽ, ബീജവും ഓസൈറ്റ് സോണ പെല്ലുസിഡാ52 തമ്മിലുള്ള പ്രതിപ്രവർത്തനം സുഗമമാക്കുന്നു.
ഞങ്ങളുടെ AlphaFold തിരയൽ IZUMO1, SPACA6 4HB, TMEM95 എന്നിവയ്‌ക്കായി മറ്റൊരു പൊരുത്തം കണ്ടെത്തി.TMEM95, ഒരു ബീജ-നിർദ്ദിഷ്‌ട ട്രാൻസ്‌മെംബ്രൺ പ്രോട്ടീൻ, 32,33 ഇല്ലാതാക്കുമ്പോൾ പുരുഷ എലികളെ വന്ധ്യമാക്കുന്നു.TMEM95 ഇല്ലാത്ത ബീജസങ്കലനത്തിന് സാധാരണ രൂപഘടനയും ചലനശേഷിയും സോണ പെല്ലൂസിഡയിൽ തുളച്ചുകയറാനും മുട്ടയുടെ സ്തരവുമായി ബന്ധിപ്പിക്കാനുമുള്ള കഴിവ് ഉണ്ടായിരുന്നു, പക്ഷേ ഓസൈറ്റ് മെംബ്രണുമായി സംയോജിപ്പിക്കാൻ കഴിഞ്ഞില്ല.മുമ്പത്തെ പഠനങ്ങൾ TMEM95 IZUMO133 മായി ഘടനാപരമായ സമാനതകൾ പങ്കിടുന്നു.തീർച്ചയായും, ആൽഫഫോൾഡ് മോഡൽ TMEM95 എന്നത് IZUMO1, SPACA6 എന്നിവയുടെ അതേ ജോടി CXXC മോട്ടിഫുകളുള്ള 4HB ആണെന്നും SPACA6-ൽ കണ്ടെത്തിയ ഹെലിസുകൾ 1, 2 എന്നിവയ്ക്കിടയിലുള്ള അതേ അധിക ഡൈസൾഫൈഡ് ബോണ്ടും (ചിത്രം 3a, S11) സ്ഥിരീകരിച്ചു.TMEM95-ന് Ig-പോലുള്ള ഒരു ഡൊമെയ്‌ൻ ഇല്ലെങ്കിലും, SPACA6, IZUMO1 ഹിഞ്ച് മേഖലകൾക്ക് സമാനമായ ഒരു ഡൈസൾഫൈഡ് ബോണ്ട് പാറ്റേൺ ഉള്ള ഒരു പ്രദേശം ഇതിന് ഉണ്ട് (ചിത്രം 3b).ഈ കൈയെഴുത്തുപ്രതി പ്രസിദ്ധീകരിക്കുന്ന സമയത്ത്, പ്രീപ്രിന്റ് സെർവർ TMEM95-ന്റെ ഘടന റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തു, ഇത് AlphaFold53 ഫലം സ്ഥിരീകരിച്ചു.TMEM95, SPACA6, IZUMO1 എന്നിവയുമായി വളരെ സാമ്യമുള്ളതാണ്, ഇത് ഇതിനകം തന്നെ ഉഭയജീവികളിൽ പരിണാമപരമായി സംരക്ഷിക്കപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു (ചിത്രം 4, S13).
PSI-BLAST തിരച്ചിൽ NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP, SOF1 ഡാറ്റാബേസുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ജീവന്റെ വൃക്ഷത്തിലെ ഈ ശ്രേണികളുടെ സ്ഥാനം നിർണ്ണയിക്കാൻ ഉപയോഗിച്ചു.ബ്രാഞ്ച് പോയിന്റുകൾ തമ്മിലുള്ള ദൂരം സ്കെയിൽ കാണിക്കുന്നില്ല.
SPACA6 ഉം IZUMO1 ഉം തമ്മിലുള്ള ശ്രദ്ധേയമായ മൊത്തത്തിലുള്ള ഘടനാപരമായ സാമ്യം സൂചിപ്പിക്കുന്നത് അവർ TMEM95, IZUMO 2, 3, 4 പ്രോട്ടീനുകൾ ഉൾപ്പെടുന്ന ഒരു സംരക്ഷിത ഘടനാപരമായ സൂപ്പർ ഫാമിലിയുടെ സ്ഥാപക അംഗങ്ങളാണെന്നാണ്.അറിയപ്പെടുന്ന അംഗങ്ങൾ: IZUMO1, SPACA6, TMEM95.കുറച്ച് അംഗങ്ങൾക്ക് മാത്രമേ Ig പോലുള്ള ഡൊമെയ്‌നുകൾ ഉള്ളൂ എന്നതിനാൽ, 4HB ഡൊമെയ്‌നാണ് IST സൂപ്പർഫാമിലിയുടെ മുഖമുദ്ര, ഈ പ്രോട്ടീനുകൾക്കെല്ലാം പൊതുവായുള്ള സവിശേഷമായ സവിശേഷതകളുണ്ട്: 1) ഒരു ആന്റി-പാരലൽ/പാരലൽ ആൾട്ടർനേഷനിൽ ക്രമീകരിച്ചിരിക്കുന്ന ഹെലിസുകളുള്ള കോയിൽഡ് 4HB (ചിത്രം . 5a), 2) ബണ്ടിലിനുള്ളിൽ രണ്ട് ഹെലിസുകളും മൂന്നാമത്തെ ലംബമായ ഹെലിക്സും അടങ്ങുന്ന ഒരു ത്രികോണ മുഖമുണ്ട് (ചിത്രം. കീ ഏരിയ (ചിത്രം. 5c). തിയോറെഡോക്സിൻ പോലുള്ള പ്രോട്ടീനുകളിൽ കാണപ്പെടുന്ന CXXC മോട്ടിഫ്, പ്രവർത്തിക്കുമെന്ന് അറിയപ്പെടുന്നു. ഒരു റെഡോക്‌സ് സെൻസർ 54,55,56 എന്ന നിലയിൽ, IST കുടുംബാംഗങ്ങളിലെ മോട്ടിഫ് ഗെയിമറ്റ് ഫ്യൂഷനിൽ ERp57 പോലുള്ള പ്രോട്ടീൻ ഡൈസൾഫൈഡ് ഐസോമറേസുകളുമായി ബന്ധപ്പെടുത്താം.
4HB ഡൊമെയ്‌നിന്റെ മൂന്ന് സ്വഭാവ സവിശേഷതകളാൽ IST സൂപ്പർഫാമിലിയിലെ അംഗങ്ങളെ നിർവചിച്ചിരിക്കുന്നു: സമാന്തരവും ആൻറിപാരലൽ ഓറിയന്റേഷനും തമ്മിൽ മാറിമാറി വരുന്ന നാല് ഹെലിസുകൾ, BA-ത്രികോണ ഹെലിക്കൽ ബണ്ടിൽ മുഖങ്ങൾ, ചെറിയ തന്മാത്രകൾക്കിടയിൽ രൂപപ്പെട്ട ഒരു ca CXXC ഇരട്ട മോട്ടിഫ്.) എൻ-ടെർമിനൽ ഹെലിക്സുകളും (ഓറഞ്ച്) ഹിഞ്ച് മേഖലയും β-ഹെയർപിൻ (പച്ച).
SPACA6 ഉം IZUMO1 ഉം തമ്മിലുള്ള സാമ്യം കണക്കിലെടുത്ത്, IZUMO1 അല്ലെങ്കിൽ JUNO എന്നിവയുമായി ബന്ധിപ്പിക്കാനുള്ള മുൻ കഴിവ് പരീക്ഷിച്ചു.ബയോലേയർ ഇന്റർഫെറോമെട്രി (BLI) എന്നത് IZUMO1-ഉം JUNO-ഉം തമ്മിലുള്ള പ്രതിപ്രവർത്തനം കണക്കാക്കാൻ മുമ്പ് ഉപയോഗിച്ചിരുന്ന ഒരു ചലനാത്മക-അടിസ്ഥാന ബൈൻഡിംഗ് രീതിയാണ്.JUNO അനലൈറ്റിന്റെ ഉയർന്ന സാന്ദ്രതയുള്ള ഒരു ഭോഗമായി IZUMO1 ഉപയോഗിച്ച് biotin-ലേബൽ ചെയ്‌ത സെൻസർ ഇൻകുബേഷൻ ചെയ്‌ത ശേഷം, ശക്തമായ ഒരു സിഗ്നൽ കണ്ടെത്തി (ചിത്രം. S14a), സെൻസർ ടിപ്പിൽ ഘടിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന ബയോ മെറ്റീരിയലിന്റെ കനം ഒരു ബൈൻഡിംഗ്-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് മാറ്റത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.സമാനമായ സിഗ്നലുകൾ (അതായത്, IZUMO1 അനലിറ്റിനെതിരെയുള്ള ഒരു ഭോഗമായി സെൻസറുമായി JUNO ഘടിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു) (ചിത്രം. S14b).സെൻസർ-ബൗണ്ട് IZUMO1 അല്ലെങ്കിൽ സെൻസർ-ബൗണ്ട് JUNO (ചിത്രം S14a,b) എന്നിവയ്‌ക്കെതിരായ അനലിറ്റായി SPACA6 ഉപയോഗിച്ചപ്പോൾ ഒരു സിഗ്നലും കണ്ടെത്തിയില്ല.ഈ സിഗ്നലിന്റെ അഭാവം സൂചിപ്പിക്കുന്നത് SPACA6 ന്റെ എക്സ്ട്രാ സെല്ലുലാർ ഡൊമെയ്ൻ IZUMO1 അല്ലെങ്കിൽ JUNO യുടെ എക്സ്ട്രാ സെല്ലുലാർ ഡൊമെയ്നുമായി സംവദിക്കുന്നില്ല എന്നാണ്.
ബെയ്റ്റ് പ്രോട്ടീനിലെ സ്വതന്ത്ര ലൈസിൻ അവശിഷ്ടങ്ങളുടെ ബയോട്ടിനൈലേഷനെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ് BLI വിശകലനം എന്നതിനാൽ, ലൈസിൻ അവശിഷ്ടങ്ങൾ പരസ്പര പ്രവർത്തനത്തിൽ ഉൾപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെങ്കിൽ ഈ പരിഷ്ക്കരണത്തിന് ബൈൻഡിംഗ് തടയാൻ കഴിയും.കൂടാതെ, സെൻസറുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ബൈൻഡിംഗിന്റെ ഓറിയന്റേഷൻ സ്‌റ്റെറിക് തടസ്സങ്ങൾ സൃഷ്ടിക്കും, അതിനാൽ റീകോമ്പിനന്റ് SPACA6, IZUMO1, JUNO ectodomains എന്നിവയിലും പരമ്പരാഗത പുൾ-ഡൗൺ പരിശോധനകൾ നടത്തി.ഇതൊക്കെയാണെങ്കിലും, SPACA6 അവന്റെ ടാഗുചെയ്‌ത IZUMO1 അല്ലെങ്കിൽ അവന്റെ ടാഗ് ചെയ്‌ത JUNO (ചിത്രം. S14c,d) എന്നിവയ്‌ക്കൊപ്പമല്ല, BLI പരീക്ഷണങ്ങളിൽ നിരീക്ഷിച്ചതുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്ന ഇടപെടലുകളൊന്നും സൂചിപ്പിക്കുന്നില്ല.ഒരു പോസിറ്റീവ് കൺട്രോൾ എന്ന നിലയിൽ, അവന്റെ IZUMO1 (ചിത്രങ്ങൾ S14e, S15) എന്ന് ലേബൽ ചെയ്‌തിരിക്കുന്ന ജൂനോയുടെ ഇടപെടൽ ഞങ്ങൾ സ്ഥിരീകരിച്ചു.
SPACA6 ഉം IZUMO1 ഉം തമ്മിലുള്ള ഘടനാപരമായ സാമ്യം ഉണ്ടായിരുന്നിട്ടും, SPACA6-ന് JUNO-യെ ബന്ധിപ്പിക്കാനുള്ള കഴിവില്ലായ്മയിൽ അതിശയിക്കാനില്ല.മനുഷ്യ IZUMO1 ന്റെ ഉപരിതലത്തിൽ JUNO യുമായി ഇടപഴകുന്ന 20-ലധികം അവശിഷ്ടങ്ങൾ ഉണ്ട്, അതിൽ ഓരോ മൂന്ന് പ്രദേശങ്ങളിൽ നിന്നുമുള്ള അവശിഷ്ടങ്ങൾ ഉൾപ്പെടുന്നു (അവയിൽ ഭൂരിഭാഗവും ഹിഞ്ച് മേഖലയിലാണ് സ്ഥിതി ചെയ്യുന്നതെങ്കിലും) (ചിത്രം. S14f).ഈ അവശിഷ്ടങ്ങളിൽ ഒന്ന് മാത്രം SPACA6 (Glu70) ൽ സംരക്ഷിക്കപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു.അവശിഷ്ടങ്ങൾ മാറ്റിസ്ഥാപിക്കുന്ന പലതും അവയുടെ യഥാർത്ഥ ബയോകെമിക്കൽ ഗുണങ്ങൾ നിലനിർത്തിയപ്പോൾ, IZUMO1 ലെ അത്യാവശ്യമായ Arg160 അവശിഷ്ടം SPACA6-ൽ നെഗറ്റീവ് ചാർജുള്ള Asp148 ഉപയോഗിച്ച് മാറ്റിസ്ഥാപിച്ചു;മുമ്പത്തെ പഠനങ്ങൾ കാണിക്കുന്നത് IZUMO1 ലെ Arg160Glu മ്യൂട്ടേഷൻ JUNO43 ലേക്ക് ബന്ധിപ്പിക്കുന്നത് പൂർണ്ണമായും ഇല്ലാതാക്കുന്നു എന്നാണ്.കൂടാതെ, IZUMO1 ഉം SPACA6 ഉം തമ്മിലുള്ള ഡൊമെയ്ൻ ഓറിയന്റേഷനിലെ വ്യത്യാസം SPACA6 (ചിത്രം S14g) ന് തുല്യമായ പ്രദേശത്തിന്റെ JUNO-ബൈൻഡിംഗ് സൈറ്റിന്റെ ഉപരിതല വിസ്തീർണ്ണം ഗണ്യമായി വർദ്ധിപ്പിച്ചു.
ഗെയിമറ്റ് ഫ്യൂഷനുവേണ്ടി SPACA6-ന്റെ ആവശ്യവും IZUMO1-ന്റെ സമാനതയും ഉണ്ടായിരുന്നിട്ടും, SPACA6-ന് തുല്യമായ JUNO ബൈൻഡിംഗ് ഫംഗ്‌ഷൻ ഉള്ളതായി കാണുന്നില്ല.അതിനാൽ, പരിണാമ ജീവശാസ്ത്രം നൽകുന്ന പ്രാധാന്യത്തിന്റെ തെളിവുകളുമായി ഞങ്ങളുടെ ഘടനാപരമായ ഡാറ്റ സംയോജിപ്പിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശ്രമിച്ചു.SPACA6 ഹോമോലോഗുകളുടെ സീക്വൻസ് വിന്യാസം സസ്തനികൾക്ക് അപ്പുറത്തുള്ള പൊതു ഘടനയുടെ സംരക്ഷണം കാണിക്കുന്നു.ഉദാഹരണത്തിന്, വിദൂര ബന്ധമുള്ള ഉഭയജീവികളിൽ പോലും സിസ്റ്റൈൻ അവശിഷ്ടങ്ങൾ ഉണ്ട് (ചിത്രം 6a).ConSurf സെർവർ ഉപയോഗിച്ച്, 66 സീക്വൻസുകളുടെ മൾട്ടിപ്പിൾ സീക്വൻസ് അലൈൻമെന്റ് നിലനിർത്തൽ ഡാറ്റ SPACA6 ഉപരിതലത്തിലേക്ക് മാപ്പ് ചെയ്തു.ഇത്തരത്തിലുള്ള വിശകലനത്തിന് പ്രോട്ടീൻ പരിണാമസമയത്ത് ഏത് അവശിഷ്ടങ്ങളാണ് സംരക്ഷിക്കപ്പെട്ടിട്ടുള്ളതെന്ന് കാണിക്കാനും ഏത് ഉപരിതല പ്രദേശങ്ങളാണ് പ്രവർത്തനത്തിൽ പങ്കുവഹിക്കുന്നതെന്ന് സൂചിപ്പിക്കാനും കഴിയും.
CLUSTAL OMEGA ഉപയോഗിച്ച് തയ്യാറാക്കിയ 12 വ്യത്യസ്ത ഇനങ്ങളിൽ നിന്നുള്ള SPACA6 എക്ടോഡോമെയ്‌നുകളുടെ ഒരു സീക്വൻസ് അലൈൻമെന്റ്.കോൺസർഫ് വിശകലനം അനുസരിച്ച്, ഏറ്റവും യാഥാസ്ഥിതിക സ്ഥാനങ്ങൾ നീല നിറത്തിൽ അടയാളപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു.സിസ്റ്റൈൻ അവശിഷ്ടങ്ങൾ ചുവപ്പ് നിറത്തിൽ ഹൈലൈറ്റ് ചെയ്തിരിക്കുന്നു.ഡൊമെയ്‌ൻ അതിരുകളും ദ്വിതീയ ഘടന ഘടകങ്ങളും വിന്യാസത്തിന്റെ മുകളിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു, ഇവിടെ അമ്പടയാളങ്ങൾ β-സ്ട്രാൻഡുകളെയും തരംഗങ്ങൾ ഹെലിസുകളെയും സൂചിപ്പിക്കുന്നു.സീക്വൻസുകൾ അടങ്ങുന്ന എൻസിബിഐ ആക്സസ് ഐഡന്റിഫയറുകൾ ഇവയാണ്: ഹ്യൂമൻ (ഹോമോ സാപിയൻസ്, NP_001303901), മാൻഡ്രിൽ (മാൻഡ്രിലസ് ല്യൂക്കോഫേയസ്, XP_011821277), കാപ്പുച്ചിൻ കുരങ്ങ് (സെബസ് മിമിക്, XP_017359300 caball2, horse2 Killer2, XP_60), le (Orcinus orca3_23 XP_032_034) .), ആടുകൾ (Ovis aris, XP_014955560), ആന (Loxodonta africana, XP_010585293), നായ (Canis lupus familyis, XP_025277208), എലി (Mus musculus, NP_0011563001, Tasharman6philus,156381), XP_0318), പ്ലാറ്റിപസ്, 8) , 61_89, ബുൾഫ്രോഗ് (Bufo bufo, XP_040282113).മനുഷ്യ ക്രമത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ് നമ്പറിംഗ്.b കോൺസർഫ് സെർവറിൽ നിന്നുള്ള കൺസർവേഷൻ എസ്റ്റിമേറ്റ് അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള നിറങ്ങൾ, മുകളിൽ 4HB ഉം താഴെ Ig-പോലുള്ള ഡൊമെയ്‌നും ഉള്ള SPACA6 ഘടനയുടെ ഉപരിതല പ്രാതിനിധ്യം.ഏറ്റവും നന്നായി സംരക്ഷിച്ചിരിക്കുന്ന ഭാഗങ്ങൾ നീല നിറത്തിലും, മിതമായ രീതിയിൽ സംരക്ഷിച്ചിരിക്കുന്ന ഭാഗങ്ങൾ വെള്ളയിലും, ഏറ്റവും കുറവ് സംരക്ഷിക്കപ്പെട്ടവ മഞ്ഞയിലുമാണ്.ധൂമ്രനൂൽ സിസ്റ്റൈൻ.ഉയർന്ന തലത്തിലുള്ള സംരക്ഷണം പ്രകടമാക്കുന്ന മൂന്ന് ഉപരിതല പാച്ചുകൾ ഇൻസെറ്റ് ലേബൽ ചെയ്ത പാച്ചുകളിൽ 1, 2, 3 എന്നിവയിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. മുകളിൽ വലതുവശത്തുള്ള ഇൻസെറ്റിൽ ഒരു 4HB കാർട്ടൂൺ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു (അതേ വർണ്ണ സ്കീം).
SPACA6 ഘടനയ്ക്ക് മൂന്ന് ഉയർന്ന സംരക്ഷിത ഉപരിതല മേഖലകളുണ്ട് (ചിത്രം 6 ബി).പാച്ച് 1 4HB-ലും ഹിഞ്ച് മേഖലയിലും വ്യാപിച്ചുകിടക്കുന്നു, അതിൽ രണ്ട് സംരക്ഷിത CXXC ഡൈസൾഫൈഡ് ബ്രിഡ്ജുകൾ, ഒരു Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 ഹിഞ്ച് നെറ്റ്‌വർക്ക് (ചിത്രം. S7), കൂടാതെ മൂന്ന് സംരക്ഷിത ബാഹ്യ ആരോമാറ്റിക് അവശിഷ്ടങ്ങൾ (Phe31, Tyr73, Phe1373) എന്നിവ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു.ബീജത്തിന്റെ ഉപരിതലത്തിൽ പോസിറ്റീവ് ചാർജുള്ള നിരവധി അവശിഷ്ടങ്ങളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന Ig-പോലുള്ള ഡൊമെയ്‌നിന്റെ (ചിത്രം. S6e) വിശാലമായ ഒരു റിം.രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, ഈ പാച്ചിൽ ഒരു ആന്റിബോഡി എപ്പിറ്റോപ്പ് അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു, അത് SPACA6 30 പ്രവർത്തനത്തെ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നതായി മുമ്പ് കാണിച്ചിരുന്നു.Ig-പോലുള്ള ഡൊമെയ്‌നിന്റെ ഹിംഗും ഒരു വശവും മേഖല 3 വ്യാപിച്ചുകിടക്കുന്നു;ഈ മേഖലയിൽ സംരക്ഷിത പ്രോലൈനുകളും (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) പുറത്തേക്ക് അഭിമുഖീകരിക്കുന്ന പോളാർ/ചാർജ്ജ് ചെയ്ത അവശിഷ്ടങ്ങളും അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു.അതിശയകരമെന്നു പറയട്ടെ, 4HB യുടെ ഉപരിതലത്തിലുള്ള ഭൂരിഭാഗം അവശിഷ്ടങ്ങളും വളരെ വേരിയബിൾ ആണ് (ചിത്രം 6b), എന്നിരുന്നാലും SPACA6 ഹോമോലോഗ് (ഹൈഡ്രോഫോബിക് ബണ്ടിൽ കോറിന്റെ യാഥാസ്ഥിതികത സൂചിപ്പിക്കുന്നത് പോലെ) കൂടാതെ IST സൂപ്പർ ഫാമിലിക്ക് അപ്പുറത്തും ഫോൾഡ് സംരക്ഷിക്കപ്പെടുന്നു.
കണ്ടെത്താനാകുന്ന ദ്വിതീയ ഘടന ഘടകങ്ങളുടെ ഏറ്റവും കുറവ് SPACA6-ലെ ഏറ്റവും ചെറിയ മേഖലയാണെങ്കിലും, SPACA6 ഹോമോലോഗുകൾക്കിടയിൽ നിരവധി ഹിഞ്ച് റീജിയൻ അവശിഷ്ടങ്ങൾ (മേഖല 3 ഉൾപ്പെടെ) വളരെയധികം സംരക്ഷിക്കപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു, ഇത് ഹെലിക്കൽ ബണ്ടിലിന്റെയും β-സാൻഡ്‌വിച്ചിന്റെയും ഓറിയന്റേഷൻ ഒരു പങ്ക് വഹിക്കുന്നുണ്ടെന്ന് സൂചിപ്പിക്കാം.ഒരു യാഥാസ്ഥിതികനായി.എന്നിരുന്നാലും, SPACA6, IZUMO1 എന്നിവയുടെ ഹിഞ്ച് മേഖലയിൽ വിപുലമായ ഹൈഡ്രജൻ ബോണ്ടിംഗും ഇലക്ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് നെറ്റ്‌വർക്കുകളും ഉണ്ടെങ്കിലും, IZUMO137,43,44-ന്റെ അനുവദനീയമായ ഒന്നിലധികം ഘടനകളുടെ വിന്യാസത്തിൽ ആന്തരിക വഴക്കത്തിന്റെ തെളിവുകൾ കാണാൻ കഴിയും.വ്യക്തിഗത ഡൊമെയ്‌നുകളുടെ വിന്യാസം നന്നായി ഓവർലാപ്പ് ചെയ്‌തു, എന്നാൽ പരസ്പരം ആപേക്ഷികമായി ഡൊമെയ്‌നുകളുടെ ഓറിയന്റേഷൻ കേന്ദ്ര അക്ഷത്തിൽ നിന്ന് 50 ° മുതൽ 70 ° വരെ വ്യത്യാസപ്പെടുന്നു (ചിത്രം S16).ലായനിയിൽ SPACA6 ന്റെ അനുരൂപമായ ചലനാത്മകത മനസ്സിലാക്കാൻ, SAXS പരീക്ഷണങ്ങൾ നടത്തി (ചിത്രം. S17a,b).SPACA6 ectodomain-ന്റെ ആദ്യ പുനർനിർമ്മാണം ഒരു വടി ക്രിസ്റ്റൽ ഘടനയുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു (ചിത്രം. S18), എന്നിരുന്നാലും ക്രാറ്റ്കി പ്ലോട്ട് ഒരു പരിധിവരെ വഴക്കം കാണിക്കുന്നു (ചിത്രം. S17b).ഈ അനുരൂപീകരണം IZUMO1 മായി വ്യത്യസ്‌തമാണ്, അതിൽ അൺബൗണ്ട് പ്രോട്ടീൻ ലാറ്റിസിലും ലായനിയിലും ഒരു ബൂമറാംഗ് ആകൃതി സ്വീകരിക്കുന്നു.
ഫ്ലെക്സിബിൾ മേഖലയെ പ്രത്യേകമായി തിരിച്ചറിയാൻ, ഹൈഡ്രജൻ-ഡ്യൂറ്റീരിയം എക്സ്ചേഞ്ച് മാസ് സ്പെക്ട്രോസ്കോപ്പി (H-DXMS) SPACA6-ൽ നടത്തി, മുമ്പ് IZUMO143-ൽ ലഭിച്ച ഡാറ്റയുമായി താരതമ്യം ചെയ്തു (ചിത്രം 7a,b).SPACA6 വ്യക്തമായും IZUMO1 നേക്കാൾ വഴക്കമുള്ളതാണ്, 100,000 സെക്കൻഡ് എക്സ്ചേഞ്ച് കഴിഞ്ഞ് ഘടനയിലുടനീളം ഉയർന്ന ഡ്യൂട്ടീരിയം എക്സ്ചേഞ്ച് സൂചിപ്പിക്കുന്നത്.രണ്ട് ഘടനകളിലും, ഹിഞ്ച് മേഖലയുടെ സി-ടെർമിനൽ ഭാഗം ഉയർന്ന തലത്തിലുള്ള കൈമാറ്റം കാണിക്കുന്നു, ഇത് പരസ്പരം ആപേക്ഷികമായി 4HB, Ig-പോലുള്ള ഡൊമെയ്‌നുകളുടെ പരിമിതമായ ഭ്രമണം അനുവദിക്കുന്നു.രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, 147CDLPLDCP154 അവശിഷ്ടങ്ങൾ അടങ്ങിയ SPACA6 ഹിഞ്ചിന്റെ C-ടെർമിനൽ ഭാഗം വളരെ സംരക്ഷിത പ്രദേശമാണ് 3 (ചിത്രം. 6b), ഇത് ഇന്റർഡൊമെയ്ൻ ഫ്ലെക്സിബിലിറ്റി SPACA6 ന്റെ പരിണാമപരമായി സംരക്ഷിക്കപ്പെട്ട സവിശേഷതയാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.ഫ്ലെക്സിബിലിറ്റി വിശകലനം അനുസരിച്ച്, സിഡി തെർമൽ മെൽറ്റ് ഡാറ്റ SPACA6 (Tm = 51.2 ° C) IZUMO1 (Tm = 62.9 ° C) (ചിത്രം. S1e, S19) എന്നതിനേക്കാൾ സ്ഥിരത കുറവാണെന്ന് കാണിച്ചു.
SPACA6, b IZUMO1 എന്നിവയുടെ ഒരു H-DXMS ചിത്രങ്ങൾ.ഡ്യൂട്ടീരിയം എക്സ്ചേഞ്ച് ശതമാനം സൂചിപ്പിച്ച സമയ പോയിന്റുകളിൽ നിർണ്ണയിച്ചു.ഹൈഡ്രജൻ-ഡ്യൂറ്റീരിയം എക്സ്ചേഞ്ചിന്റെ അളവ് നീല (10%) മുതൽ ചുവപ്പ് (90%) വരെയുള്ള ഗ്രേഡിയന്റ് സ്കെയിലിൽ നിറം സൂചിപ്പിക്കുന്നു.ബ്ലാക്ക് ബോക്സുകൾ ഉയർന്ന വിനിമയ മേഖലകളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.ക്രിസ്റ്റൽ ഘടനയിൽ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ട 4HB, ഹിഞ്ച്, Ig-പോലുള്ള ഡൊമെയ്‌നുകളുടെ അതിരുകൾ പ്രാഥമിക ക്രമത്തിന് മുകളിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.SPACA6, IZUMO1 എന്നിവയുടെ സുതാര്യമായ തന്മാത്രാ പ്രതലങ്ങളിൽ സൂപ്പർഇമ്പോസ് ചെയ്‌തിരിക്കുന്ന ഒരു സ്ട്രിപ്പ് ചാർട്ടിൽ 10 സെ, 1000 സെ, 100,000 സെക്കന്റുകളിലുള്ള ഡ്യൂട്ടീരിയം എക്സ്ചേഞ്ച് ലെവലുകൾ പ്ലോട്ട് ചെയ്‌തു.50% ൽ താഴെയുള്ള ഡ്യൂറ്റീരിയം എക്സ്ചേഞ്ച് ലെവൽ ഉള്ള ഘടനകളുടെ ഭാഗങ്ങൾ വെളുത്ത നിറമുള്ളതാണ്.50% H-DXMS എക്സ്ചേഞ്ചിനു മുകളിലുള്ള ഏരിയകൾ ഗ്രേഡിയന്റ് സ്കെയിലിൽ നിറമുള്ളതാണ്.
CRISPR/Cas9, മൗസ് ജീൻ നോക്കൗട്ട് ജനിതക തന്ത്രങ്ങൾ എന്നിവയുടെ ഉപയോഗം ബീജത്തെയും അണ്ഡത്തെയും ബന്ധിപ്പിക്കുന്നതിനും സംയോജിപ്പിക്കുന്നതിനും പ്രധാനപ്പെട്ട നിരവധി ഘടകങ്ങളെ തിരിച്ചറിയുന്നതിലേക്ക് നയിച്ചു.IZUMO1-JUNO, CD9 ഘടനയുടെ നല്ല സ്വഭാവസവിശേഷതയുള്ള പ്രതിപ്രവർത്തനം കൂടാതെ, ഗെയിമറ്റ് ഫ്യൂഷനുമായി ബന്ധപ്പെട്ട മിക്ക പ്രോട്ടീനുകളും ഘടനാപരമായും പ്രവർത്തനപരമായും നിഗൂഢമായി തുടരുന്നു.SPACA6-ന്റെ ബയോഫിസിക്കൽ, സ്ട്രക്ചറൽ സ്വഭാവം ബീജസങ്കലനസമയത്ത് അഡീഷൻ/ഫ്യൂഷൻ തന്മാത്രാ പസിലിന്റെ മറ്റൊരു ഭാഗമാണ്.
SPACA6 ഉം IST സൂപ്പർ ഫാമിലിയിലെ മറ്റ് അംഗങ്ങളും സസ്തനികളിലും വ്യക്തിഗത പക്ഷികൾ, ഉരഗങ്ങൾ, ഉഭയജീവികൾ എന്നിവയിലും വളരെയധികം സംരക്ഷിക്കപ്പെട്ടതായി കാണപ്പെടുന്നു;വാസ്തവത്തിൽ, സീബ്രാഫിഷ് 59-ൽ ബീജസങ്കലനത്തിന് പോലും SPACA6 ആവശ്യമാണെന്ന് കരുതപ്പെടുന്നു. DCST134, DCST234, FIMP31, SOF132 തുടങ്ങിയ അറിയപ്പെടുന്ന ഗെയിമറ്റ് ഫ്യൂഷൻ-അനുബന്ധ പ്രോട്ടീനുകൾക്ക് സമാനമാണ് ഈ വിതരണവും, ഈ ഘടകങ്ങൾ HAP2-അപര്യാപ്തമാണെന്ന് നിർദ്ദേശിക്കുന്നു (കൂടാതെ GCS1 എന്നറിയപ്പെടുന്നു) പല പ്രോട്ടിസ്റ്റുകളുടെയും ഉത്തേജക പ്രവർത്തനത്തിന് കാരണമാകുന്ന പ്രോട്ടീനുകൾ., സസ്യങ്ങൾ, ആർത്രോപോഡുകൾ.ഫെർട്ടിലൈസ്ഡ് ഫ്യൂഷൻ പ്രോട്ടീനുകൾ 60, 61. SPACA6 ഉം IZUMO1 ഉം തമ്മിലുള്ള ശക്തമായ ഘടനാപരമായ സാമ്യം ഉണ്ടായിരുന്നിട്ടും, ഈ പ്രോട്ടീനുകളിലേതെങ്കിലും എൻകോഡ് ചെയ്യുന്ന ജീനുകളുടെ നോക്കൗട്ട് പുരുഷ എലികളിൽ വന്ധ്യതയ്ക്ക് കാരണമായി, ഇത് ഗെയിമറ്റ് ഫ്യൂഷനിലെ അവയുടെ പ്രവർത്തനങ്ങൾ ഇരട്ടിയല്ലെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു..കൂടുതൽ വിശാലമായി പറഞ്ഞാൽ, സംയോജനത്തിന്റെ അഡീഷൻ ഘട്ടത്തിന് ആവശ്യമായ അറിയപ്പെടുന്ന ബീജ പ്രോട്ടീനുകളൊന്നും അനാവശ്യമല്ല.
SPACA6 (ഒപ്പം IST സൂപ്പർ ഫാമിലിയിലെ മറ്റ് അംഗങ്ങളും) ഇന്റർഗാമെറ്റിക് ജംഗ്ഷനുകളിൽ പങ്കെടുക്കുന്നുണ്ടോ, പ്രധാന പ്രോട്ടീനുകളെ ഫ്യൂഷൻ പോയിന്റുകളിലേക്ക് റിക്രൂട്ട് ചെയ്യുന്നതിനായി ഇൻട്രാഗമെറ്റിക് നെറ്റ്‌വർക്കുകൾ രൂപീകരിക്കുന്നുണ്ടോ, അല്ലെങ്കിൽ ഒരുപക്ഷേ അവ്യക്തമായ ഫ്യൂസോജനുകളായി പ്രവർത്തിക്കുന്നുണ്ടോ എന്നത് ഒരു തുറന്ന ചോദ്യമായി അവശേഷിക്കുന്നു.HEK293T സെല്ലുകളിലെ കോ-ഇമ്യൂണോപ്രെസിപിറ്റേഷൻ പഠനങ്ങൾ പൂർണ്ണ ദൈർഘ്യമുള്ള IZUMO1 ഉം SPACA632 ഉം തമ്മിലുള്ള പ്രതിപ്രവർത്തനം വെളിപ്പെടുത്തി.എന്നിരുന്നാലും, ഞങ്ങളുടെ റീകോമ്പിനന്റ് എക്ടോഡോമെയ്‌നുകൾ വിട്രോയിൽ സംവദിച്ചില്ല, ഇത് നോഡയിലും മറ്റുള്ളവരിലും കാണുന്ന ഇടപെടലുകളെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.നിർമ്മാണത്തിൽ ഇവ രണ്ടും ഇല്ലാതാക്കി (IZUMO1 ന്റെ സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് ടെയിൽ ശ്രദ്ധിക്കുക, ഇത് ബീജസങ്കലനത്തിന് ആവശ്യമില്ലെന്ന് കാണിക്കുന്നു62).മറ്റൊരുതരത്തിൽ, IZUMO1 കൂടാതെ/അല്ലെങ്കിൽ SPACA6-ന് ഫിസിയോളജിക്കൽ സ്പെസിഫിക് കോൺഫോർമേഷനുകൾ അല്ലെങ്കിൽ മറ്റ് പ്രോട്ടീനുകൾ അടങ്ങിയ മോളിക്യുലാർ കോംപ്ലക്സുകൾ (അറിയപ്പെടുന്നതോ ഇതുവരെ കണ്ടെത്തിയിട്ടില്ലാത്തതോ) പോലെ, വിട്രോയിൽ പുനർനിർമ്മിക്കാത്ത നിർദ്ദിഷ്ട ബൈൻഡിംഗ് പരിതസ്ഥിതികൾ ആവശ്യമായി വന്നേക്കാം.IZUMO1 എക്ടോഡോമെയ്ൻ പെരിവിറ്റലൈൻ സ്‌പെയ്‌സിലെ അണ്ഡവുമായി ബീജവുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് മധ്യസ്ഥത വഹിക്കുമെന്ന് വിശ്വസിക്കപ്പെടുന്നുണ്ടെങ്കിലും, SPACA6 എക്‌ടോഡോമെയ്‌നിന്റെ ഉദ്ദേശ്യം വ്യക്തമല്ല.
പ്രോട്ടീൻ-പ്രോട്ടീൻ ഇടപെടലുകളിൽ ഉൾപ്പെട്ടേക്കാവുന്ന നിരവധി സംരക്ഷിത പ്രതലങ്ങളെ SPACA6-ന്റെ ഘടന വെളിപ്പെടുത്തുന്നു.CXXC മോട്ടിഫിനോട് (മുകളിൽ നിയുക്ത പാച്ച് 1) തൊട്ടുകിടക്കുന്ന ഹിഞ്ച് മേഖലയുടെ സംരക്ഷിത ഭാഗത്ത്, ജൈവ തന്മാത്രകൾക്കിടയിലുള്ള ഹൈഡ്രോഫോബിക്, π- സ്റ്റാക്കിംഗ് ഇടപെടലുകളുമായി പലപ്പോഴും ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന ബാഹ്യമായി അഭിമുഖീകരിക്കുന്ന അരോമാറ്റിക് അവശിഷ്ടങ്ങളുണ്ട്.Ig-പോലുള്ള ഡൊമെയ്‌നിന്റെ (മേഖല 2) വിശാലമായ വശങ്ങൾ വളരെ സംരക്ഷിത Arg ഉം അവന്റെ അവശിഷ്ടങ്ങളും ഉള്ള ഒരു പോസിറ്റീവ് ചാർജുള്ള ഗ്രോവ് ഉണ്ടാക്കുന്നു, കൂടാതെ ഈ പ്രദേശത്തിനെതിരായ ആന്റിബോഡികൾ മുമ്പ് ഗെയിമറ്റ് ഫ്യൂഷൻ 30 തടയാൻ ഉപയോഗിച്ചിരുന്നു.ആന്റിബോഡി ലീനിയർ എപ്പിറ്റോപ്പ് 212RIRPAQLTHRGTFS225 തിരിച്ചറിയുന്നു, അതിൽ മൂന്നെണ്ണം ആറ് അർജിനൈൻ അവശിഷ്ടങ്ങളും ഉയർന്ന സംരക്ഷിത ഹിസ്220 ഉണ്ട്.ഈ പ്രത്യേക അവശിഷ്ടങ്ങളുടെ തടസ്സം മൂലമാണോ അതോ പ്രദേശം മുഴുവനായും പ്രവർത്തനരഹിതമായതാണോ എന്ന് വ്യക്തമല്ല.β-സാൻഡ്‌വിച്ചിന്റെ സി-ടെർമിനസിനടുത്തുള്ള ഈ വിടവിന്റെ സ്ഥാനം അയൽ ബീജ പ്രോട്ടീനുകളുമായുള്ള സിസ്-ഇന്ററാക്ഷനുകളെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു, പക്ഷേ ഓസൈറ്റ് പ്രോട്ടീനുകളുമായുള്ളതല്ല.കൂടാതെ, ഹിംഗിനുള്ളിൽ വളരെ ഫ്ലെക്സിബിൾ ആയ പ്രോലിൻ സമ്പുഷ്ടമായ ടാംഗിൾ (സൈറ്റ് 3) നിലനിർത്തുന്നത് ഒരു പ്രോട്ടീൻ-പ്രോട്ടീൻ ഇടപെടലിന്റെ സൈറ്റായിരിക്കാം അല്ലെങ്കിൽ, രണ്ട് ഡൊമെയ്‌നുകൾക്കിടയിലുള്ള വഴക്കം നിലനിർത്തുന്നതിനെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.SPACA6-ന്റെ അജ്ഞാതമായ റോളിന് ലിംഗഭേദം പ്രധാനമാണ്.ഗെയിമറ്റുകളുടെ സംയോജനം.
SPACA6-ന് Ig-പോലുള്ള β-സാൻഡ്‌വിച്ചുകൾ ഉൾപ്പെടെയുള്ള ഇന്റർസെല്ലുലാർ അഡീഷൻ പ്രോട്ടീനുകളുടെ ഗുണങ്ങളുണ്ട്.ഒട്ടനവധി പ്രോട്ടീനുകൾ (ഉദാ, കാദറിൻസ്, ഇന്റഗ്രിൻ, അഡ്‌സിനുകൾ, IZUMO1) ഒന്നോ അതിലധികമോ β-സാൻഡ്‌വിച്ച് ഡൊമെയ്‌നുകൾ കൈവശം വയ്ക്കുന്നു, അത് കോശ സ്‌തരത്തിൽ നിന്ന് പ്രോട്ടീനുകളെ അവയുടെ പാരിസ്ഥിതിക ലക്ഷ്യങ്ങളിലേക്ക് വ്യാപിപ്പിക്കുന്നു63,64,65.SPACA6-ന്റെ Ig-സമാനമായ ഡൊമെയ്‌നിൽ β-സാൻഡ്‌വിച്ചുകളിൽ അഡീഷൻ, കോഹഷൻ എന്നിവയിൽ സാധാരണയായി കാണപ്പെടുന്ന ഒരു മോട്ടിഫ് അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു: മെക്കാനിക്കൽ ക്ലാമ്പുകൾ 66 എന്നറിയപ്പെടുന്ന β-സാൻഡ്‌വിച്ചുകളുടെ അറ്റത്തുള്ള സമാന്തര സ്ട്രോണ്ടുകളുടെ ഇരട്ടി.ഈ മോട്ടിഫ് കത്രിക ശക്തികളോടുള്ള പ്രതിരോധം വർദ്ധിപ്പിക്കുമെന്ന് വിശ്വസിക്കപ്പെടുന്നു, ഇത് ഇന്റർസെല്ലുലാർ ഇടപെടലുകളിൽ ഉൾപ്പെടുന്ന പ്രോട്ടീനുകൾക്ക് വിലപ്പെട്ടതാണ്.എന്നിരുന്നാലും, അഡ്‌സിനുകളുമായുള്ള ഈ സാമ്യം ഉണ്ടായിരുന്നിട്ടും, SPACA6 മുട്ടയുടെ വെള്ളയുമായി ഇടപഴകുന്നു എന്നതിന് നിലവിൽ തെളിവുകളൊന്നുമില്ല.SPACA6 ectodomain-ന് JUNO-മായി ബന്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയുന്നില്ല, ഇവിടെ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ SPACA6-എക്‌സ്‌പ്രസ് ചെയ്യുന്ന HEK293T സെല്ലുകൾ സോണ 32 ഇല്ലാത്ത ഓസൈറ്റുകളുമായി സംവദിക്കുന്നില്ല.SPACA6 ഇന്റർഗാമെറ്റിക് ബോണ്ടുകൾ സ്ഥാപിക്കുകയാണെങ്കിൽ, ഈ ഇടപെടലുകൾക്ക് വിവർത്തനാനന്തര പരിഷ്ക്കരണങ്ങളോ മറ്റ് ബീജ പ്രോട്ടീനുകളുടെ സ്ഥിരതയോ ആവശ്യമായി വന്നേക്കാം.പിന്നീടുള്ള സിദ്ധാന്തത്തെ പിന്തുണയ്‌ക്കുന്നതിനായി, IZUMO1-ന്യൂനപക്ഷ ബീജസങ്കലനം ഓസൈറ്റുകളുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നു, IZUMO1 ഒഴികെയുള്ള തന്മാത്രകൾ ഗെയിമറ്റ് അഡീഷൻ ഘട്ടം 27-ൽ ഉൾപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെന്ന് തെളിയിക്കുന്നു.
പല വൈറൽ, സെല്ലുലാർ, ഡെവലപ്‌മെന്റ് ഫ്യൂഷൻ പ്രോട്ടീനുകൾക്കും ഫ്യൂസോജനുകളായി അവയുടെ പ്രവർത്തനം പ്രവചിക്കുന്ന ഗുണങ്ങളുണ്ട്.ഉദാഹരണത്തിന്, വൈറൽ ഫ്യൂഷൻ ഗ്ലൈക്കോപ്രോട്ടീനുകൾക്ക് (ക്ലാസ്സുകൾ I, II, III) പ്രോട്ടീന്റെ അറ്റത്ത് ഒരു ഹൈഡ്രോഫോബിക് ഫ്യൂഷൻ പെപ്റ്റൈഡ് അല്ലെങ്കിൽ ലൂപ്പ് ഉണ്ട്, അത് ഹോസ്റ്റ് മെംബ്രണിലേക്ക് ചേർക്കുന്നു.IZUMO143-ന്റെ ഹൈഡ്രോഫിലിസിറ്റി മാപ്പും IST സൂപ്പർ ഫാമിലിയുടെ ഘടനയും (നിർണ്ണയിച്ചതും പ്രവചിച്ചതും) വ്യക്തമായ ഹൈഡ്രോഫോബിക് ഫ്യൂഷൻ പെപ്റ്റൈഡൊന്നും കാണിച്ചില്ല.അങ്ങനെ, IST സൂപ്പർ ഫാമിലിയിലെ ഏതെങ്കിലും പ്രോട്ടീനുകൾ ഫ്യൂസോജനുകളായി പ്രവർത്തിക്കുന്നുണ്ടെങ്കിൽ, അറിയപ്പെടുന്ന മറ്റ് ഉദാഹരണങ്ങളിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമായ രീതിയിലാണ് അവ പ്രവർത്തിക്കുന്നത്.
ഉപസംഹാരമായി, ഗെയിമറ്റ് ഫ്യൂഷനുമായി ബന്ധപ്പെട്ട പ്രോട്ടീനുകളുടെ IST സൂപ്പർ ഫാമിലിയിലെ അംഗങ്ങളുടെ പ്രവർത്തനങ്ങൾ ഒരു ദുരൂഹമായ രഹസ്യമായി തുടരുന്നു.ഞങ്ങളുടെ സവിശേഷതയായ SPACA6 റീകോമ്പിനന്റ് തന്മാത്രയും അതിന്റെ പരിഹരിച്ച ഘടനയും ഈ പങ്കിട്ട ഘടനകൾ തമ്മിലുള്ള ബന്ധത്തെക്കുറിച്ചും ഗെയിമറ്റ് അറ്റാച്ച്‌മെന്റിലും സംയോജനത്തിലും അവയുടെ പങ്കിനെ കുറിച്ചും ഉൾക്കാഴ്ച നൽകും.
പ്രവചിക്കപ്പെട്ട ഹ്യൂമൻ SPACA6 എക്‌ടോഡോമെയ്‌നുമായി ബന്ധപ്പെട്ട DNA ക്രമം (NCBI പ്രവേശന നമ്പർ NP_001303901.1; അവശിഷ്ടങ്ങൾ 27-246) ഡ്രോസോഫില മെലനോഗാസ്റ്റർ S2 സെല്ലുകളിൽ ആവിഷ്‌കരിക്കുന്നതിന് കോഡൺ-ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്‌ത് കോഡൺ-ഓപ്‌റ്റിമൈസ് ചെയ്‌തു, കൂടാതെ കോഡൺ-ഓപ്‌റ്റിമൈസ് ചെയ്‌തു, കോഡോണിന്റെ സീക്വൻസ് എൻകോഡിംഗ് ഉപയോഗിച്ച് ഒരു ജീൻ ശകലമായി സമന്വയിപ്പിച്ചു., BiP സ്രവിക്കുന്ന സിഗ്നലും അനുബന്ധ 5′, 3′ എന്നിവയും ഈ ജീനിന്റെ ലിഗേഷൻ-ഇൻഡിപെൻഡന്റ് ക്ലോണിംഗിനായി ഒരു pMT എക്സ്പ്രഷൻ വെക്റ്ററിലേക്ക് പ്യൂറോമൈസിൻ (pMT-puro) ഉപയോഗിച്ച് തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നതിനായി പരിഷ്കരിച്ച മെറ്റലോത്തയോണിൻ പ്രൊമോട്ടറിനെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ്.pMT-puro വെക്റ്റർ 10x-ഹിസ് C-ടെർമിനൽ ടാഗ് (ചിത്രം S2) ഒരു ത്രോംബിൻ ക്ലീവേജ് സൈറ്റിനെ എൻകോഡ് ചെയ്യുന്നു.
IZUMO1, JUNO43 എന്നിവയ്‌ക്ക് ഉപയോഗിക്കുന്ന പ്രോട്ടോക്കോളിന് സമാനമായി SPACA6 pMT-puro വെക്‌ടറിന്റെ D. മെലനോഗാസ്റ്റർ S2 (ഗിബ്‌കോ) സെല്ലുകളിലേക്കുള്ള സ്ഥിരമായ കൈമാറ്റം നടത്തി.S2 സെല്ലുകൾ ഉരുകുകയും ഷ്നൈഡറിന്റെ മീഡിയത്തിൽ (ഗിബ്‌കോ) വളർത്തുകയും 10% (v/v) ഹീറ്റ്-ഇൻക്ടിവേറ്റഡ് ഫീറ്റൽ കാൾഫ് സെറം (ഗിബ്‌കോ), 1X ആന്റിമൈക്കോട്ടിക് ആൻറിബയോട്ടിക് (ഗിബ്‌കോ) എന്നിവയുടെ അന്തിമ സാന്ദ്രതയോടെ അനുബന്ധമായി നൽകുകയും ചെയ്തു.ആദ്യകാല പാസേജ് സെല്ലുകൾ (3.0 x 106 സെല്ലുകൾ) 6-കിണർ പ്ലേറ്റുകളുടെ (കോർണിംഗ്) വ്യക്തിഗത കിണറുകളിൽ പൂശിയിരിക്കുന്നു.27 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 24 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേഷനുശേഷം, നിർമ്മാതാവിന്റെ പ്രോട്ടോക്കോൾ അനുസരിച്ച് 2 മില്ലിഗ്രാം SPACA6 pMT-puro വെക്‌ടറിന്റെയും എഫക്റ്റീൻ ട്രാൻസ്‌ഫെക്ഷൻ റിയാജന്റെയും (Qiagen) മിശ്രിതം ഉപയോഗിച്ച് കോശങ്ങൾ മാറ്റി.കൈമാറ്റം ചെയ്യപ്പെട്ട കോശങ്ങൾ 72 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും പിന്നീട് 6 mg/ml പ്യൂറോമൈസിൻ ഉപയോഗിച്ച് വിളവെടുക്കുകയും ചെയ്തു.പിന്നീട് പൂർണ്ണമായ ഷ്നൈഡറുടെ മാധ്യമത്തിൽ നിന്ന് കോശങ്ങൾ വേർതിരിച്ചെടുക്കുകയും വലിയ തോതിലുള്ള പ്രോട്ടീൻ ഉൽപാദനത്തിനായി സെറം ഫ്രീ ഇൻസെക്റ്റ്-എക്സ്പ്രസ് മീഡിയത്തിൽ (ലോൻസ) സ്ഥാപിക്കുകയും ചെയ്തു.1 L ബാച്ച് S2 സെൽ കൾച്ചർ 2 L വായുസഞ്ചാരമുള്ള ഫ്ലാറ്റ്-ബോട്ടം പോളിപ്രൊഫൈലിൻ Erlenmeyer ഫ്ലാസ്കിൽ 8-10 × 106 ml-1 സെല്ലുകളായി വളർത്തി, തുടർന്ന് 500 µM CuSO4 (മില്ലിപോർ സിഗ്മ) ഫിൽട്ടർ ചെയ്ത അന്തിമ സാന്ദ്രത ഉപയോഗിച്ച് അണുവിമുക്തമാക്കി.പ്രേരിപ്പിച്ചത്.പ്രേരിത സംസ്‌കാരങ്ങൾ 27 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 120 ആർപിഎമ്മിൽ നാല് ദിവസത്തേക്ക് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു.
SPACA6 അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന കണ്ടീഷൻ ചെയ്ത മീഡിയം 4 °C യിൽ 5660×g-ൽ സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ വഴി വേർതിരിച്ചു, തുടർന്ന് 10 kDa MWCO മെംബ്രണോടുകൂടിയ സെൻട്രമേറ്റ് ടാൻജൻഷ്യൽ ഫ്ലോ ഫിൽട്രേഷൻ സിസ്റ്റം (പാൽ കോർപ്).SPACA6 അടങ്ങിയ സാന്ദ്രീകൃത മീഡിയം 2 ml Ni-NTA അഗറോസ് റെസിൻ (Qiagen) നിരയിലേക്ക് പ്രയോഗിക്കുക.Ni-NTA റെസിൻ ബഫർ A യുടെ 10 കോളം വോള്യങ്ങൾ (CV) ഉപയോഗിച്ച് കഴുകി, തുടർന്ന് 1 CV ബഫർ A ചേർത്ത് 50 mM ന്റെ അന്തിമ ഇമിഡാസോൾ സാന്ദ്രത നൽകുകയും ചെയ്തു.SPACA6 500 mM ന്റെ അന്തിമ സാന്ദ്രതയിലേക്ക് ഇമിഡാസോൾ ഉപയോഗിച്ച് 10 മില്ലി ബഫർ എ ഉപയോഗിച്ച് ഒഴിവാക്കി.ഡയാലിസിസിനായി 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl (ബഫർ B) എന്നിവയ്‌ക്കെതിരെ ഒരു mg SPACA6 എന്ന നിരക്കിൽ 1 യൂണിറ്റ് എന്ന തോതിൽ ഡയാലിസിസ് ട്യൂബിലേക്ക് (MWCO 12-14 kDa) നിയന്ത്രണ ക്ലാസ് ത്രോംബിൻ (Millipore Sigma) നേരിട്ട് ചേർത്തു.4 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 48 മണിക്കൂർ.ത്രോംബിൻ-ക്ലീവ്ഡ് SPACA6 ഉപ്പിന്റെ സാന്ദ്രത കുറയ്ക്കാൻ മൂന്ന് തവണ നേർപ്പിക്കുകയും 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 ഉപയോഗിച്ച് സമതുലിതമായ 1 ml MonoS 5/50 GL കാറ്റേഷൻ എക്സ്ചേഞ്ച് കോളത്തിൽ (Cytiva/GE) ലോഡ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.കേഷൻ എക്സ്ചേഞ്ചർ 3 OK 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 ഉപയോഗിച്ച് കഴുകി, തുടർന്ന് SPACA6 10 mm Tris-HCl-ൽ 0 മുതൽ 500 mm NaCl, pH 7.5-ന് 25 OK എന്നിവയിൽ ലീനിയർ ഗ്രേഡിയന്റ് ഉപയോഗിച്ച് എല്യൂട്ടുചെയ്‌തു.അയോൺ എക്സ്ചേഞ്ച് ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫിക്ക് ശേഷം, SPACA6 1 മില്ലി ആയി കേന്ദ്രീകരിക്കുകയും ബഫർ B ഉപയോഗിച്ച് സമതുലിതമാക്കിയ ENrich SEC650 10 x 300 കോളം (BioRad) ൽ നിന്ന് ഐസോക്രാറ്റിക്ക് ആയി എല്യൂട്ടുചെയ്യുകയും ചെയ്തു.16% SDS-polyacrylamide ജെല്ലിലെ Coomassie-stained electrophoresis ആണ് പരിശുദ്ധി നിയന്ത്രിച്ചത്.ബിയർ-ലാംബെർട്ട് നിയമവും സൈദ്ധാന്തിക മോളാർ എക്‌സ്‌റ്റിൻക്ഷൻ കോഫിഫിഷ്യന്റും ഉപയോഗിച്ച് 280 nm-ൽ ആഗിരണം ചെയ്യുന്നതിലൂടെ പ്രോട്ടീൻ സാന്ദ്രത കണക്കാക്കി.
ശുദ്ധീകരിച്ച SPACA6 10 mM സോഡിയം ഫോസ്ഫേറ്റ്, pH 7.4, 150 mM NaF എന്നിവയ്‌ക്കെതിരെ ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് ഡയാലിസ് ചെയ്യുകയും സിഡി സ്പെക്ട്രോസ്കോപ്പി വിശകലനം ചെയ്യുന്നതിന് മുമ്പ് 0.16 mg/mL വരെ നേർപ്പിക്കുകയും ചെയ്തു.185 മുതൽ 260 nm വരെ തരംഗദൈർഘ്യമുള്ള CD-കളുടെ സ്പെക്ട്രൽ സ്കാനിംഗ് ഒരു Jasco J-1500 സ്പെക്ട്രോപോളാരിമീറ്ററിൽ 1 mm ഒപ്റ്റിക്കൽ പാത്ത് ദൈർഘ്യമുള്ള (ഹെൽമ) 25 ° C യിൽ 50 nm/min എന്ന നിരക്കിൽ ക്വാർട്സ് ക്യൂവെറ്റുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ശേഖരിച്ചു.സിഡി സ്പെക്ട്ര അടിസ്ഥാന രേഖ ശരിയാക്കി, ശരാശരി 10 ഏറ്റെടുക്കലുകൾ നടത്തി, ഡിഗ്രി cm2/dmol-ൽ ബാക്കിയുള്ള ദീർഘവൃത്താകൃതി (θMRE) ആയി പരിവർത്തനം ചെയ്തു:
ഇവിടെ MW എന്നത് Da-യിലെ ഓരോ സാമ്പിളിന്റെയും തന്മാത്രാ ഭാരം;N എന്നത് അമിനോ ആസിഡുകളുടെ എണ്ണമാണ്;θ എന്നത് മില്ലിഡിഗ്രികളിലെ ദീർഘവൃത്തമാണ്;d സെ.മിയിലെ ഒപ്റ്റിക്കൽ പാതയുടെ ദൈർഘ്യവുമായി യോജിക്കുന്നു;യൂണിറ്റുകളിലെ പ്രോട്ടീൻ സാന്ദ്രത.