310 10*1 എംഎം സ്റ്റെയിൻലെസ് സ്റ്റീൽ കോയിൽഡ് ട്യൂബിംഗ് കെമിക്കൽ ഘടകം, സ്പിഡ്രോയിന്റെ എൻ-ടെർമിനൽ ഡൊമെയ്‌നുകൾ അമിലോയ്ഡ് ഫൈബ്രിലുകളെ അടിസ്ഥാനമാക്കി ഹൈഡ്രോജലുകൾ രൂപപ്പെടുത്തുകയും പ്രോട്ടീൻ ഇമ്മൊബിലൈസേഷന് ഒരു പ്ലാറ്റ്ഫോം നൽകുകയും ചെയ്യുന്നു.

Nature.com സന്ദർശിച്ചതിന് നന്ദി.പരിമിതമായ CSS പിന്തുണയുള്ള ഒരു ബ്രൗസർ പതിപ്പാണ് നിങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്നത്.മികച്ച അനുഭവത്തിനായി, നിങ്ങൾ ഒരു അപ്‌ഡേറ്റ് ചെയ്‌ത ബ്രൗസർ ഉപയോഗിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു (അല്ലെങ്കിൽ Internet Explorer-ൽ അനുയോജ്യത മോഡ് പ്രവർത്തനരഹിതമാക്കുക).കൂടാതെ, നിലവിലുള്ള പിന്തുണ ഉറപ്പാക്കാൻ, ഞങ്ങൾ ശൈലികളും JavaScript ഇല്ലാതെ സൈറ്റ് കാണിക്കുന്നു.
ഓരോ സ്ലൈഡിലും മൂന്ന് ലേഖനങ്ങൾ കാണിക്കുന്ന സ്ലൈഡറുകൾ.സ്ലൈഡുകളിലൂടെ നീങ്ങാൻ ബാക്ക്, അടുത്ത ബട്ടണുകൾ ഉപയോഗിക്കുക അല്ലെങ്കിൽ ഓരോ സ്ലൈഡിലൂടെയും നീങ്ങാൻ അവസാനത്തെ സ്ലൈഡ് കൺട്രോളർ ബട്ടണുകൾ ഉപയോഗിക്കുക.

സ്പെസിഫിക്കേഷൻ

310 10*1mm സ്റ്റെയിൻലെസ്സ് സ്റ്റീൽ കോയിൽഡ് ട്യൂബിംഗ് വിതരണക്കാർ

കെമിക്കൽ കോമ്പോസിഷൻ

മെക്കാനിക്കൽ പ്രോപ്പർട്ടികൾ

റീകോമ്പിനന്റ് സ്പൈഡർ സിൽക്ക് പ്രോട്ടീനുകൾക്ക് (സ്പൈഡർ സിൽക്ക് പ്രോട്ടീനുകൾ) പുതിയ ബയോ മെറ്റീരിയലുകളുടെ വികസനത്തിൽ നിരവധി സാധ്യതകളുണ്ട്, എന്നാൽ അവയുടെ മൾട്ടിമോഡൽ, അഗ്രഗേഷൻ സാധ്യതയുള്ള സ്വഭാവം അവ ലഭിക്കാൻ പ്രയാസകരവും ഉപയോഗിക്കാൻ എളുപ്പവുമാക്കുന്നു.റീകോമ്പിനന്റ് മിനിയേച്ചർ സ്പൈഡ്രോയിൻ പ്രോട്ടീനുകളും, പ്രധാനമായി, N-ടെർമിനൽ ഡൊമെയ്‌നും (NT) തന്നെ 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ സ്വയം-പിന്തുണയുള്ളതും സുതാര്യവുമായ ഹൈഡ്രോജലുകൾ രൂപപ്പെടുന്നതായി ഞങ്ങൾ ഇവിടെ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുന്നു.NT, ഗ്രീൻ ഫ്ലൂറസെന്റ് പ്രോട്ടീൻ അല്ലെങ്കിൽ പ്യൂരിൻ ന്യൂക്ലിയോസൈഡ് ഫോസ്ഫോറിലേസ് എന്നിവ അടങ്ങിയ ഫ്യൂഷൻ പ്രോട്ടീനുകൾ പൂർണ്ണമായും പ്രവർത്തനക്ഷമമായ ഫ്യൂഷൻ പ്രോട്ടീനുകൾ ഉണ്ടാക്കുന്നു.ഹൈഡ്രോജലുകൾ.റീകോമ്പിനന്റ് എൻ.ടി.യും ഫ്യൂഷൻ പ്രോട്ടീനുകളും ഉയർന്ന എക്സ്പ്രഷൻ വിളവ് നൽകുകയും ഹൈഡ്രോജലുകൾക്ക് സുതാര്യത, ക്രോസ്ലിങ്ക് ചെയ്യാതെയുള്ള ജിലേഷൻ, ഉയർന്ന സാന്ദ്രതയിൽ സജീവമായ പ്രോട്ടീനുകളുടെ നേരിട്ടുള്ള നിശ്ചലീകരണം എന്നിവ പോലുള്ള ആകർഷകമായ ഗുണങ്ങൾ നൽകുകയും ചെയ്യുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു.
ചിലന്തികൾക്ക് ഏഴ് വ്യത്യസ്ത സെറ്റ് സിൽക്ക് ഗ്രന്ഥികളുണ്ട്, അവ ഓരോന്നും ഒരു പ്രത്യേക തരം പട്ട് ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്നു.ഏഴ് സിൽക്ക് സ്പീഷീസുകളും സ്പൈഡർ സിൽക്ക് പ്രോട്ടീനുകൾ (സ്പൈഡ്രോയിനുകൾ) ഏകദേശം 6000 അവശിഷ്ടങ്ങൾ കൊണ്ട് നിർമ്മിതമാണ്, കൂടാതെ ഗോളാകൃതിയിലുള്ള N-, C-ടെർമിനൽ ഡൊമെയ്‌നുകളാൽ ചുറ്റപ്പെട്ട ഒരു വലിയ കേന്ദ്ര ആവർത്തന മേഖല (NT, CT) 1,2 എന്നിവ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു.പ്രൈമറി ആമ്പുള്ള ഗ്രന്ഥി ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്നതാണ് ഏറ്റവും വ്യാപകമായി പഠിക്കപ്പെട്ട പട്ടുനൂൽ.ഈ ഗ്രന്ഥിയിൽ, എപ്പിത്തീലിയൽ സെല്ലുകളുടെ ഒരു ഏകപാളി സ്പിഡ്രോയിൻ പ്രോട്ടീനുകളെ സമന്വയിപ്പിക്കുകയും ഗ്രന്ഥിയുടെ ല്യൂമനിലേക്ക് സ്രവിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു, അവിടെ അവ വളരെ ഉയർന്ന സാന്ദ്രതയിൽ (30-50% w/v) 3,4 ലയിക്കുന്ന രൂപത്തിൽ (ഡോപ്പിംഗ്) കാണപ്പെടുന്നു.ഗ്രന്ഥിയിലെ പ്രധാന ആംപുള്ളർ സ്പൈഡ്രോയിൻ പ്രോട്ടീനുകളുടെ ഓർഗനൈസേഷനും അനുരൂപീകരണവും ചർച്ച ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്, എന്നാൽ മിക്ക പരീക്ഷണാത്മക തെളിവുകളും പൊതുവെ ഹെലിക്കൽ കൂടാതെ/അല്ലെങ്കിൽ ക്രമരഹിതമായ ഹെലിക്കൽ കോൺഫോർമേഷൻ, മൈക്കെല്ലാർ അല്ലെങ്കിൽ ലാമെല്ലാർ ഘടനകൾ എന്നിവ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.ആവർത്തിച്ചുള്ള ഡൊമെയ്‌നുകൾ സിൽക്ക് നാരുകളുടെ മെക്കാനിക്കൽ ഗുണങ്ങളെ നിയന്ത്രിക്കുമ്പോൾ, β-ഷീറ്റ് നാനോക്രിസ്റ്റലുകളും രൂപരഹിതമായ ഘടനകളും 11,12,13,14,15 രൂപീകരിക്കുന്നു, എൻഡ് ഡൊമെയ്‌നുകൾ സിൽക്ക് ഗ്രന്ഥിയിലെ മാറിക്കൊണ്ടിരിക്കുന്ന അവസ്ഥകളോടുള്ള പ്രതികരണമായി സിൽക്ക് നാരുകളെ നിയന്ത്രിക്കുന്നു16,17,18.സിൽക്ക് രൂപീകരണം നിയന്ത്രിക്കുന്നതിലൂടെ, 19. ടെർമിനൽ ഡൊമെയ്‌നുകൾ പരിണാമപരമായി സംരക്ഷിക്കപ്പെടുന്നു, അവയുടെ പ്രവർത്തനം എല്ലാ സ്‌പിഡ്രോയിൻ പ്രോട്ടീനുകളിലും 2,20,21 പൊതുവായിരിക്കാം.ഗ്രന്ഥിയിലൂടെ കടന്നുപോകുമ്പോൾ, സ്പിഡ്രോയിന്റെ pH ഏകദേശം 7.6-ൽ നിന്ന് <5.716 ആയി കുറയുന്നു, ക്രമേണ ഇടുങ്ങിയ നാളിയിലൂടെയുള്ള ചലനത്തിന്റെ മധ്യസ്ഥതയിൽ കത്രികയും നീറ്റലും വർദ്ധിക്കുന്നു.ലായനിയിൽ, CT ഒരു α-ഹെലിക്കൽ കോൺസ്റ്റിറ്റ്യൂട്ടീവ് പാരലൽ ഡൈമർ17 ആണ്, എന്നാൽ കുറഞ്ഞ pH, ഷിയർ ഫോഴ്‌സുകൾ എന്നിവയ്‌ക്ക് മറുപടിയായി, CT വികസിക്കുകയും β-ലെയറുകൾ 16, 17 സ്വിച്ച് ചെയ്യുകയും ചെയ്യുന്നു, ഇത് 16, 16, പരിവർത്തനത്തിന്റെ ആവർത്തന മേഖലകളിൽ β-ലെയറുകൾ പ്രവർത്തനക്ഷമമാക്കാൻ സാധ്യതയുണ്ട്. ഗ്രന്ഥിയുടെ ല്യൂമനിലെ അവസ്ഥകളെ പ്രതിഫലിപ്പിക്കുന്ന അവസ്ഥകളും സ്പിഡ്രോയിന്റെ ലയിക്കുന്നതിലും മധ്യസ്ഥത വഹിക്കുന്നു, എന്നാൽ പിഎച്ച് കുറയുമ്പോൾ, നിരവധി കാർബോക്‌സിലിക് ആസിഡ് സൈഡ് ചെയിനുകളുടെ പ്രോട്ടോണേഷൻ ഏകദേശം 6.5 pKa ഉള്ള NT യുടെ ഡൈമറൈസേഷനിലേക്ക് നയിക്കുന്നു, അതുവഴി NT സ്ഥിരത കൈവരിക്കുകയും സ്‌പൈഡ്രോയിനെ വലിയ അളവിൽ ഉറപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു. അളവ്.നെറ്റ്‌വർക്കുകൾ16,18.അങ്ങനെ, ഫിലമെന്റ് രൂപീകരണത്തിൽ NT ഒരു പ്രധാന പങ്ക് വഹിക്കുന്നു, കോട്ടിംഗിലെ ഒരു മോണോമറിൽ നിന്ന് ഫൈബർ23,24,25 ലെ ഒരു ഡൈമറിലേക്ക് മാറുന്നു.16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29 വരെ പഠിച്ച എല്ലാ സാഹചര്യങ്ങളിലും NT വളരെ ലയിക്കുന്നതും ഹെലിക്കലായി തുടരുന്നു, ഇത് ഹെറ്ററോളജിക്കൽ പ്രോട്ടീനുകളുടെ ഉൽപാദനത്തിനുള്ള ഒരു സോളിബിലിറ്റി വർദ്ധിപ്പിക്കുന്ന ലേബലായി അതിന്റെ വികസനത്തിന് പ്രചോദനമായി.
റീകോമ്പിനന്റ് മിനി സ്പൈഡർ സിൽക്ക് പ്രോട്ടീൻ, ഒരു NT, ഒരു ഷോർട്ട് റിപ്പീറ്റ് റീജിയൻ, ഒരു CT, ശുദ്ധീകരണത്തിനുള്ള His6 ടാഗ് (His-NT2RepCT) എന്നിവ അടങ്ങുന്ന, നേറ്റീവ് സ്പൈഡർ സിൽക്ക് പ്രോട്ടീൻ പോലെ ജലീയ ബഫറിൽ ലയിക്കുന്നതും സിൽക്ക് സ്പൈഡറിന്റെ പ്രാദേശിക പ്രധാന സ്വഭാവസവിശേഷതകളെ അനുകരിക്കുന്നതുമാണ്. .കവറേജ് 25.31.പിഎച്ച് 525,32,33,34,35 വാട്ടർ ബാത്തിലേക്ക് പിഎച്ച് 8 ലയിക്കുന്ന പൂശുന്ന ഒരു ബയോമിമെറ്റിക് മെഷീൻ ഉപയോഗിച്ച് ഹിസ്-എൻടി2റെപ്സിടിയെ തുടർച്ചയായ നാരുകളാക്കി മാറ്റാനാകും.E. coli-ന്റെ ബയോ റിയാക്ടർ അഴുകൽ അവന്റെ-NT2RepCT പ്രകടിപ്പിക്കുകയും തുടർന്നുള്ള ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം ശുദ്ധീകരണത്തിന് ശേഷം 14 g/L വിളവ് ലഭിക്കുകയും ചെയ്തു.ഉയർന്ന വിളവ്, ഉയർന്ന ലായകത, അമ്ലാവസ്ഥകളോടുള്ള His-NT2RepCT യുടെ മതിയായ പ്രതികരണം എന്നിവയെല്ലാം NT23, 25, 34 എന്നിവയ്ക്ക് കാരണമാകുന്നു.
37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ പ്രോട്ടീൻ ലായനി ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുന്നതിലൂടെ NT മാത്രം ഉൾപ്പെടെയുള്ള റീകോമ്പിനന്റ് സ്പൈഡ്രോയിൻ പ്രോട്ടീനുകളിൽ നിന്ന് സുതാര്യമായ ഹൈഡ്രോജലുകളുടെ ദ്രുത രൂപീകരണം ഞങ്ങൾ ഇവിടെ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുന്നു.തയോഫ്ലേവിൻ ടി ഫ്ലൂറസെൻസ് (ThT), ഫോറിയർ ട്രാൻസ്ഫോർമേഷൻ ഇൻഫ്രാറെഡ് സ്പെക്ട്രോസ്കോപ്പി (FTIR), ന്യൂക്ലിയർ മാഗ്നെറ്റിക് റെസൊണൻസ് സ്പെക്ട്രോസ്കോപ്പി (NMR), ട്രാൻസ്മിഷൻ ഇലക്ട്രോൺ മൈക്രോസ്കോപ്പി (TEM) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് NT, മൈക്രോസ്പൈഡർ പ്രോട്ടീനുകൾ ഘടനാപരമായ പരിവർത്തനത്തിന് വിധേയമാകുന്നത് β-ലൈക്ക് ഫൈബർ ഷീറ്റുകളിലേക്കും അമിലോയിഡ് ഷീറ്റുകളിലേക്കും ആമിലോയിഡ് ഷീറ്റുകളിലേക്കും ആമിലോയിഡ് ഷീറ്റുകളിലേക്കും മാറുന്നു. ജെല്ലുകൾ രൂപപ്പെടുമ്പോൾ.കൂടാതെ, NT, ഗ്രീൻ ഫ്ലൂറസെന്റ് പ്രോട്ടീൻ (GFP) അല്ലെങ്കിൽ പ്യൂരിൻ ന്യൂക്ലിയോസൈഡ് ഫോസ്ഫോറിലേസ് (PNP) എന്നിവയുടെ ഫ്യൂഷൻ പ്രോട്ടീനുകൾ പൂർണ്ണമായും പ്രവർത്തനക്ഷമമായ ഫ്യൂഷൻ ശകലങ്ങളുള്ള ഹൈഡ്രോജലുകൾ ഉണ്ടാക്കുന്നു.ഫിസിയോളജിക്കൽ സാഹചര്യങ്ങളിൽ ഹൈഡ്രോജലുകളുടെ ദ്രുതഗതിയിലുള്ള രൂപീകരണത്തോടൊപ്പം, ഹെറ്ററോളജിക്കൽ ഹോസ്റ്റുകളിലെ ഉയർന്ന ത്രൂപുട്ട് എക്സ്പ്രഷൻ, എഞ്ചിനീയറിംഗ് ഫംഗ്ഷനുകളുള്ള ഹൈഡ്രോജലുകളുടെ ചെലവ് കുറഞ്ഞ ഉൽപാദനത്തിനുള്ള സാധ്യത തുറക്കുന്നു.
റികോമ്പിനന്റ് സ്പൈഡ്രോയിൻ പ്രോട്ടീനുകളിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമായി, His-NT2RepCT ട്രിസ്-എച്ച്സിഎൽ ബഫറിൽ pH 8-ൽ സ്ഥിരതയുള്ളതാണ്, കൂടാതെ മഴ കൂടാതെ 500 mg/mL വരെ കേന്ദ്രീകരിക്കാനും കഴിയും.അതിനാൽ, ഈ പ്രോട്ടീൻ 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ (ചിത്രം 1 ബി-ഡി) ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുമ്പോൾ ഒപ്റ്റിക്കൽ ക്ലിയർ, സ്വയം-പിന്തുണയുള്ള ഹൈഡ്രോജലുകൾ അതിവേഗം രൂപം കൊള്ളുന്നത് ഞങ്ങൾ ആശ്ചര്യപ്പെടുത്തി.കൂടുതൽ പഠനങ്ങൾ കാണിക്കുന്നത്, His-NT2RepCT gelation പ്രോട്ടീൻ സാന്ദ്രതയുടെ (10-300 mg/mL) ഒരു വിശാലമായ ശ്രേണിയിൽ സംഭവിച്ചുവെന്നും ഈ ഏകാഗ്രത ജെലേഷൻ സമയവുമായി വിപരീതമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നുവെന്നും (ചിത്രം 1c, അനുബന്ധ ചിത്രം 1).His-NT2RepCT യുടെ ഏത് ഭാഗമാണ് ഹൈഡ്രോജൽ രൂപീകരണത്തിന് മധ്യസ്ഥത വഹിക്കുന്നതെന്ന് കണ്ടെത്താൻ, ഞങ്ങൾ ഓരോ ഡൊമെയ്‌നും വ്യക്തിഗതമായും വിവിധ കോമ്പിനേഷനുകളിലും ഒരു ഫ്ലാസ്ക് ഇൻവേർഷൻ അസ്സേ ഉപയോഗിച്ച് പരിശോധിച്ചു (ചിത്രം 1a,b).റികോമ്പിനന്റ് സ്പിഡ്രോയിന്റെ എല്ലാ പരീക്ഷിച്ച ഭിന്നസംഖ്യകളും 1 മണിക്കൂറിൽ താഴെയുള്ള ജെല്ലുകൾ (300 മില്ലിഗ്രാം / മില്ലി പ്രോട്ടീൻ സാന്ദ്രതയിൽ) രൂപപ്പെട്ടു, അവശിഷ്ടമായ 2Rep ഒഴികെ (ചിത്രം 1 ബി).NT, CT എന്നിവയ്ക്ക് മാത്രം, സംയോജിതമായോ അല്ലെങ്കിൽ ആവർത്തനങ്ങളുമായി ബന്ധപ്പെട്ടോ, 37°C-ൽ ജെൽ ചെയ്യാൻ കഴിയുമെന്നും His6 ടാഗ് ഈ പ്രക്രിയയെ കാര്യമായ അളവിൽ ബാധിക്കില്ലെന്നും ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.എൻ‌ടി വളരെ ലയിക്കുന്നതും സ്ഥിരതയുള്ളതുമായ പ്രോട്ടീനാണ്, കൂടാതെ റികോമ്പിനന്റ് സ്‌പിഡ്രോയിൻ ഹൈഡ്രോജലുകളുടെ മുൻ റിപ്പോർട്ടുകൾ ആവർത്തിച്ചുള്ള പ്രദേശങ്ങളിലും/അല്ലെങ്കിൽ CT കളിലും അനുരൂപമായ മാറ്റങ്ങളാൽ ഗെലേഷൻ ഇഫക്റ്റുകൾക്ക് കാരണമായിട്ടുണ്ട് എന്ന പൊതുവായ ധാരണ കണക്കിലെടുക്കുമ്പോൾ, NT ന് തന്നെ കഴിയും.ജിലേഷന്റെ കണ്ടെത്തൽ അപ്രതീക്ഷിതമായിരുന്നു.സപ്ലിമെന്ററി ടേബിൾ 1) 37, 38, 39. ശ്രദ്ധേയമായി, NT ഇതിനകം 10 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ ≥ 300 mg/mL സാന്ദ്രതയിൽ (ചിത്രം 1c).NT യുടെ വിവിധ സാന്ദ്രതകളുള്ള വിയൽ ഇൻവേർഷൻ പരീക്ഷണങ്ങൾ കാണിക്കുന്നത്>50 mg/mL-ൽ NT ലായനി ഹിസ്-NT2RepCT-നേക്കാൾ വേഗത്തിലാണ് ജെല്ലിംഗ് അനുബന്ധ സാന്ദ്രതയിൽ (w/v, ചിത്രം 1c).
ഈ കൃതിയിൽ പഠിച്ച വിവിധ സ്പിഡ്രോയിൻ ഘടനകളുടെ സ്കീമാറ്റിക് പ്രാതിനിധ്യം.b വിവിധ റീകോമ്പിനന്റ് സ്പൈഡ്രോയിൻ പ്രോട്ടീനുകൾക്ക് (300 mg/mL) 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ജെൽ സമയം കുപ്പി മറിച്ചുകൊണ്ട് പരിശോധിച്ചു.ഇൻകുബേഷൻ ഇല്ലാതെ ഉടൻ CT ജെൽ (<300 mg/mL), 2Rep precipitates (300 mg/mL, 5 mm സ്കെയിൽ).c 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ സൂചിപ്പിച്ച പ്രോട്ടീൻ സാന്ദ്രതയിൽ His-NT2RepCT, NT എന്നിവയുടെ ജെൽ സമയം.d ഹിസ്-NT2RepCT, NT ഹൈഡ്രോജലുകളുടെ ഫോട്ടോഗ്രാഫുകൾ ചിലന്തിയും അടിയിൽ "NT" എന്ന അക്ഷരവും യഥാക്രമം അച്ചടിച്ചിരിക്കുന്നു (രണ്ടും 200 mg/mL, സ്കെയിൽ ബാർ 5 mm).
വിവിധ റീകോമ്പിനന്റ് സ്പിഡ്രോയിൻ പ്രോട്ടീനുകളാൽ രൂപം കൊള്ളുന്ന ഹൈഡ്രോജലുകൾക്ക് അല്പം വ്യത്യസ്തമായ നിറങ്ങളുണ്ട്, കൂടാതെ നഗ്നനേത്രങ്ങളാൽ നിരീക്ഷിക്കുന്നത് വ്യത്യസ്ത അളവിലുള്ള സുതാര്യത കാണിക്കുന്നു (ചിത്രം 1 ബി).NT ജെല്ലുകൾ അസാധാരണമാംവിധം വ്യക്തമാണ്, മറ്റ് ജെല്ലുകൾ അതാര്യമാകും.സിലിണ്ടർ ട്യൂബുകളിലേക്ക് ഇട്ട അവന്റെ-NT2RepCT, NT ജെല്ലുകൾ അച്ചിൽ നിന്ന് കേടുകൂടാതെ നീക്കം ചെയ്യാവുന്നതാണ് (ചിത്രം 1d).
പ്രകൃതിദത്ത സ്പൈഡർ സിൽക്ക് കോട്ടിംഗ് ജെൽ ഇപ്പോൾ പുനഃസംയോജിപ്പിക്കുന്ന സ്പൈഡ്രോയിൻ പ്രോട്ടീനുകളുടെ ജീലേഷന് കാരണമാകുന്നുണ്ടോ എന്ന് പരിശോധിക്കാൻ, സ്വീഡിഷ് ബ്രിഡ്ജ് സ്പൈഡറിന്റെ (ലാരിനിയോയിഡ് സ്ക്ലോപെറ്റേറിയസ്) വലിയ ആമ്പുള്ള ഗ്രന്ഥിയിൽ നിന്ന് കോട്ടിംഗുകൾ ശേഖരിച്ചു.കോട്ടിംഗുകൾ 20 mM Tris-HCl ബഫറിൽ 50 mg/mL (അളന്ന ഉണങ്ങിയ ഭാരം അടിസ്ഥാനമാക്കി) സംഭരിച്ചു, എന്നാൽ 21 ദിവസത്തെ ഇൻകുബേഷൻ സമയത്ത് 37 °C (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 2a) കണ്ടില്ല.
ഈ ജെല്ലുകളുടെ അളവ് നിർണ്ണയിക്കാൻ, ജിലേഷൻ പ്രക്രിയ പഠിക്കാനും മൊത്തത്തിലുള്ള മെക്കാനിക്കൽ ഗുണങ്ങൾ നിർണ്ണയിക്കാനും റിയോളജിക്കൽ അളവുകൾ ഉപയോഗിക്കാം.പ്രത്യേകിച്ചും, ഉയർന്ന താപനിലയിൽ സ്റ്റോറേജ് മോഡുലസ് (ഇലാസ്റ്റിറ്റി) നിരീക്ഷിക്കുന്നത് ജെല്ലിംഗ് താപനിലയെയും കോട്ടിംഗിന്റെ വിസ്കോലാസ്റ്റിക് ഗുണങ്ങളെയും കുറിച്ചുള്ള വിവരങ്ങൾ നൽകും.താപനില വർദ്ധനവ് പരീക്ഷണങ്ങൾ (പ്രകൃതിദത്ത സിൽക്ക് സ്റ്റോക്ക് സൊല്യൂഷനുകൾ ഉപയോഗിച്ചുള്ള മുൻ പഠനങ്ങളെ അടിസ്ഥാനമാക്കി 25-45 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 1°C/മിനിറ്റ് ഉപയോഗിക്കുന്നു)40,41 കാണിക്കുന്നത് താപനില കൂടുന്നതിനനുസരിച്ച് His-NT2RepCT, NT സൊല്യൂഷനുകളുടെ സ്റ്റോറേജ് മോഡുലി വർദ്ധിക്കുന്നു എന്നാണ്.വർദ്ധിച്ചു (ചിത്രം 2, അനുബന്ധ ചിത്രം 3).37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ NT നേരിട്ട് ഹിസ്-NT2RepCT ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തപ്പോൾ നിരീക്ഷിക്കപ്പെടുന്ന വേഗതയേറിയ ജെൽ സമയത്തിന് അനുസൃതമായി, His-NT2RepCT-യുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ NT മൊഡ്യൂൾ കുറഞ്ഞ താപനിലയിൽ വളരാൻ തുടങ്ങിയത് ശ്രദ്ധേയമാണ് (ചിത്രം 1).താപനിലയിലെ തുടർന്നുള്ള ഇടിവിന് ശേഷം, സ്റ്റോറേജ് മോഡുലസ് താഴ്ന്ന മൂല്യങ്ങളിലേക്ക് മടങ്ങാതെ, നഷ്ട മോഡുലസിന് മുകളിലായി നിലകൊള്ളുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 3 കാണുക), ഇത് താപപരമായി മാറ്റാനാകാത്ത സ്ഥിരതയുള്ള ജിലേഷനെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.ജീലേഷനുശേഷം, 100-500 mg/mL സാന്ദ്രതയിൽ His-NT2RepCT ഹൈഡ്രോജലുകളുടെ അന്തിമ ഇലാസ്റ്റിക് മോഡുലസ് 15 മുതൽ 330 kPa വരെയും, NT ഹൈഡ്രോജലുകളുടെ (100-500 mg/mL) അവസാന ഇലാസ്റ്റിക് മോഡുലസ് 2 മുതൽ 1400 വരെയും ആയിരുന്നു. kPa (ചിത്രം, 2, പൂർണ്ണമായ റാംപ് ഡാറ്റ) സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 3 കാണുക).
അവന്റെ-NT2RepCT (300 mg/mL) ഉം b NT (300 mg/mL) ഉം കുലുക്കത്തിനൊപ്പം അളക്കുമ്പോൾ താപനിലയിലെ മാറ്റം.അമ്പടയാളങ്ങൾ താപനില പ്രവണതയെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു, കൂടാതെ സ്റ്റോറേജ് മൊഡ്യൂൾ ഡാറ്റയുടെ ഭാരം കുറഞ്ഞ ഷേഡിംഗ് നിർമ്മാതാവ് വ്യക്തമാക്കിയതിനേക്കാൾ കുറഞ്ഞ ടോർക്ക് മൂല്യങ്ങളിൽ ഉപകരണത്തിന്റെ പരിശോധനയെ ചിത്രീകരിക്കുന്നു, ഇത് വർദ്ധിച്ച ശബ്ദത്തിന് കാരണമാകുന്നു.c ഉയർന്ന താപനില (100, 300, 500 mg/mL) ശേഷം His-NT2RepCT, NT എന്നിവയുടെ എൻഡ്-മൊഡ്യൂൾ ശേഖരണം.എല്ലാ മൊഡ്യൂൾ റീഡിംഗുകളും 0.1 Hz ആവൃത്തിയിലാണ് എടുക്കുന്നത്.
ജീലേഷനുമായി ബന്ധപ്പെട്ട അനുരൂപമായ മാറ്റങ്ങൾ അന്വേഷിക്കുന്നതിനുള്ള ഒരു സാധ്യതയുള്ള രീതി എന്ന നിലയിൽ, 37°C-ൽ ജിലേഷന് മുമ്പും ശേഷവും ഹിസ്-NT2RepCT, NT എന്നിവയുടെ FTIR സ്പെക്ട്ര ഞങ്ങൾ രേഖപ്പെടുത്തി (ചിത്രം 3a,b).പ്രതീക്ഷിച്ചതുപോലെ, His-NT2RepCT, NT സൊല്യൂഷനുകളുടെ സ്പെക്ട്ര 1645 cm-1 എന്ന ഉച്ചാരണം ബാൻഡുള്ള α-ഹെലിക്സ്/റാൻഡം കോയിൽ ദ്വിതീയ ഘടന കാണിക്കുന്ന പ്രോട്ടീനുകളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു.രണ്ട് ഹൈഡ്രോജലുകൾക്കും, 1617 cm-1, 1695 cm-1 (ചിത്രം. 3a, b) മധ്യത്തിൽ I ബാൻഡിൽ രണ്ട് കൈകൾ രൂപപ്പെടുന്നതിന് ജെലേഷൻ കാരണമായി, ഇത് ആന്റിപാരലൽ β-ഷീറ്റ് ഘടനകളുടെ രൂപവത്കരണത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.ഈ മാറ്റങ്ങൾ അതത് രണ്ടാമത്തെ ഡെറിവേറ്റീവിലും ഡിഫറൻസ് ജെലേഷൻ സ്പെക്ട്രയിലും വ്യക്തമായി കാണാം (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 4b).NT β-ലെയറിന്റെ രണ്ട് ബാൻഡുകളും His-NT2RepCT-യേക്കാൾ കൂടുതൽ പ്രകടമാണ്, NT ഹൈഡ്രോജലിലെ β-ലെയർ ബാൻഡുകളുടെ മൊത്തം ഉള്ളടക്കം NT2RepCT ഹൈഡ്രോജലിനേക്കാൾ കൂടുതലാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
His-NT2RepCT, b NT (രണ്ടും 500 mg/mL) എന്നിവയുടെ ഒരു FTIR അബ്സോർപ്ഷൻ സ്പെക്ട്ര (രണ്ടും 500 mg/mL) 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ഇൻകുബേഷന് മുമ്പും (പരിഹാരം) ശേഷവും (ജെൽ) ഇൻകുബേഷൻ.പുനഃസ്ഥാപിച്ച 50 mg/ml NT2RepCT gels, d NT എന്നിവയുടെ c TEM ഇമേജുകൾ.സ്കെയിൽ ബാർ 200 nm.അവന്റെ-NT2RepCT, NT ഹൈഡ്രോജലുകളുടെ ഇ ഫൈബർ വ്യാസങ്ങൾ.n = 100 അളന്ന ഫൈബ്രിലുകൾ, p <0.0001.പിശക് ബാറുകൾ സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷൻ കാണിക്കുന്നു.പിശക് ബാറുകളുടെ മധ്യഭാഗം ശരാശരിയാണ്.സ്റ്റാറ്റിസ്റ്റിക്കൽ വിശകലനത്തിനായി ജോടിയാക്കാത്ത ടി-ടെസ്റ്റ് (രണ്ട്-വാലുള്ള) ഉപയോഗിച്ചു.f വിവിധ റീകോമ്പിനന്റ് സ്പൈഡ്രോയിൻ പ്രോട്ടീനുകളുടെ (100 mg/mL) ThT ഫ്ലൂറസെൻസ് കുലുങ്ങാതെ 37 °C.0%, 5%, 10%, 20% വിത്തുകളുള്ള 100 mg/mL NT ജെല്ലിൽ നിന്ന് g NT (100 mg/mL) കുത്തിവയ്പ്പ് പരീക്ഷണങ്ങൾ.
ട്രാൻസ്മിഷൻ ഇലക്ട്രോൺ മൈക്രോസ്കോപ്പി (TEM) ഉപയോഗിച്ചുള്ള ജെല്ലിന്റെ വിശകലനം, ഹൈഡ്രോജലിൽ അമിലോയിഡ് പോലുള്ള ഫൈബ്രിലുകൾ അടങ്ങിയിട്ടുണ്ടെന്ന് കാണിച്ചു (ചിത്രം 3 സി, 3 ഡി).NT രൂപപ്പെട്ട ഫൈബ്രിലുകൾ നീളമേറിയതും (5-12 nm വ്യാസമുള്ളതും) ശാഖകളില്ലാത്തതുമാണ്, അതേസമയം His-NT2RepCT ഫൈബ്രിലുകൾക്ക് നീളം കുറവും വ്യാസം (7-16 nm) ഗണ്യമായി വീതിയേറിയതുമാണ് (ചിത്രം 3e).തയോഫ്ലേവിൻ ടി (ThT) പരിശോധന ഉപയോഗിച്ച് ഫൈബ്രോസിസിന്റെ ചലനാത്മകത പിന്തുടരാൻ ഈ ഫലങ്ങൾ ഞങ്ങളെ അനുവദിച്ചു.എല്ലാ റീകോമ്പിനന്റ് സ്പൈഡ്രോയിൻ പ്രോട്ടീനുകൾക്കും, സാമ്പിളുകൾ 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുമ്പോൾ ഫ്ലൂറസന്റ് സിഗ്നൽ വർദ്ധിച്ചു (ചിത്രം. 3f, അനുബന്ധ ചിത്രം. 5a).ഈ കണ്ടെത്തലിന് അനുസൃതമായി, ജെല്ലിംഗ് സാഹചര്യങ്ങളിൽ NT, His-NT2RepCT എന്നിവയുടെ സൂക്ഷ്മപരിശോധനയിൽ ThT- പോസിറ്റീവ് അഗ്രഗേറ്റുകളുടെ പ്രാദേശിക ശേഖരണം കൂടാതെ ThT ഫ്ലൂറസെൻസിൽ ഒരു ഏകീകൃത വർദ്ധനവ് കണ്ടെത്തി (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 5b,c).ThT- പോസിറ്റീവ് ഫൈബ്രിലുകളുടെ രൂപീകരണം NT, His-NTCT ടർബിഡിറ്റി (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 5d) എന്നിവയ്‌ക്കൊപ്പം ഉണ്ടായില്ല, അതായത് ജെല്ലിലെ ഫൈബ്രിലുകളുടെ ഒരു ശൃംഖല ജെൽ വ്യക്തതയിൽ വിട്ടുവീഴ്ച ചെയ്യാതെ രൂപപ്പെടാം എന്നാണ്.ചെറിയ അളവിൽ പ്രീ-ഫോംഡ് ഫൈബ്രിലുകൾ ചേർത്ത് വിതയ്ക്കുന്നത് ചില അമിലോയിഡുകളുടെ ഫൈബ്രിലിന്റെ രൂപവത്കരണത്തെ ഗണ്യമായി ത്വരിതപ്പെടുത്തും, എന്നാൽ 5%, 10% അല്ലെങ്കിൽ 20% (w/w) NT ഹൈഡ്രോകോഗുലന്റുകളുടെ ഒരു ലായനിയിൽ ചേർക്കുന്നു.സീഡിംഗ് പ്രഭാവം (ചിത്രം 3g).ഹൈഡ്രോജലിലെ ഫൈബ്രിലുകൾ താരതമ്യേന ഉറപ്പിച്ചിരിക്കുന്നതും വിത്തുകളായി ഉപയോഗിക്കാൻ കഴിയാത്തതുമാണ് ഇതിന് കാരണം.
ഉയർന്ന ഊഷ്മാവിൽ റീകോമ്പിനന്റ് സ്പൈഡ്രോയിൻ പ്രോട്ടീനുകളുടെ അപ്രതീക്ഷിത സ്വഭാവം, ജെൽ രൂപീകരണവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട അനുരൂപമായ മാറ്റങ്ങൾ തിരിച്ചറിയാൻ കൂടുതൽ ന്യൂക്ലിയർ മാഗ്നറ്റിക് റെസൊണൻസ് (എൻഎംആർ) സ്പെക്ട്രോസ്കോപ്പി പഠനങ്ങൾ നടത്താൻ പ്രേരിപ്പിച്ചു.കാലക്രമേണ 37°C-ൽ രേഖപ്പെടുത്തിയ His-NT2RepCT സൊല്യൂഷനുകളുടെ NMR സ്പെക്ട്ര, CT ഇപ്പോഴും ഭാഗികമായി മടക്കിവെച്ചിരിക്കുകയാണെന്ന് കാണിക്കുന്നു, അതേസമയം NT, 2Rep സിഗ്നലുകൾ അപ്രത്യക്ഷമായി (ചിത്രം 4a), പ്രധാനമായും NT, 2Rep എന്നിവയാണ് ഹിസ്-ന്റെ രൂപവത്കരണത്തെ ഭാഗികമായി നിയന്ത്രിച്ചത് എന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. NT2RepCT ഹൈഡ്രോജൽ.CT സിഗ്നൽ അതിന്റെ യഥാർത്ഥ തീവ്രതയുടെ 20% വരെ അറ്റൻയുവേറ്റ് ചെയ്യപ്പെട്ടു, ഇത് CT കൂടുതലും ഫിക്സഡ് ചെയ്യുകയും ഹൈഡ്രോജൽ ഘടനയിൽ ഉൾപ്പെടുത്തുകയും ചെയ്യുന്നു.CT യുടെ ഒരു ചെറിയ ഭാഗത്തിന്, പ്രീ-ഇൻകുബേറ്റഡ് സാമ്പിളിലെന്നപോലെ മൊബൈൽ ആണ്, അങ്ങനെ ലായനി NMR വഴി നിരീക്ഷിക്കപ്പെടുന്നു, സ്പെക്ട്രയ്ക്ക് ആദ്യത്തെ 10 ഘടനാപരമായ അവശിഷ്ടങ്ങൾക്കുള്ള സിഗ്നലുകൾ ഇല്ല, ഒരുപക്ഷേ His-NT2Rep യുടെ ഘടിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന ഭാഗത്തിന്റെ പ്രയാസകരമായ നിശ്ചലത മൂലമാകാം.ഹൈഡ്രോജലുകളുടെ -NT2RepCT-ന്റെ NMR സ്പെക്ട്ര, α-ഹെലിസുകളുടെയും β-പാളികളുടെയും പ്രധാന സാന്നിധ്യം വെളിപ്പെടുത്തി, ഒരു പരിധിവരെ, ക്രമരഹിതമായ കോയിൽ കൺഫർമേഷൻ (ചിത്രം 4 ബി).NT-യിൽ മാത്രമുള്ള മെഥിയോണിൻ അവശിഷ്ടങ്ങളുടെ രാസ ഷിഫ്റ്റ് വിശകലനം ഈ ഡൊമെയ്ൻ ഒരു β-ഷീറ്റ് ഘടനയിലേക്ക് പരിവർത്തനം ചെയ്തതായി കാണിച്ചു.ലായനിയിലെ NT യുടെ സമയാധിഷ്ഠിത സ്പെക്ട്ര സിഗ്നൽ തീവ്രതയിൽ ഒരു ഏകീകൃത കുറവ് കാണിച്ചു (ചിത്രം. 4c), കൂടാതെ NT ഹൈഡ്രോജലുകളുടെ സോളിഡ്-സ്റ്റേറ്റ് NMR കാണിക്കുന്നത് NT അവശിഷ്ടങ്ങളിൽ ഭൂരിഭാഗവും β-ഷീറ്റ് ഘടനകളിലേക്ക് പരിവർത്തനം ചെയ്യപ്പെടുന്നു (ചിത്രം 4d).സമാഹരിക്കാനുള്ള പ്രവണത കാരണം 2Rep-ന്റെ അനുരൂപീകരണം പ്രത്യേകം നിർണ്ണയിക്കാൻ കഴിഞ്ഞില്ല.എന്നിരുന്നാലും, NTCT, His-NT2RepCT ഹൈഡ്രോജലുകളുടെ സോളിഡ് സ്റ്റേറ്റ് NMR സ്പെക്ട്ര വളരെ സാമ്യമുള്ളതായി കാണപ്പെട്ടു (ചിത്രം. 4b; അനുബന്ധ ചിത്രം. 6b), ഹിസ്-NT2RepCT ഹൈഡ്രോജലിന്റെ ഘടനാപരമായ ഭാഗത്തിന് 2Rep സംഭാവന നൽകിയിട്ടില്ലെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.CT ഹൈഡ്രോജലുകൾക്കായി, α-ഹെലിസുകൾ, β-ഷീറ്റുകൾ, റാൻഡം ഹെലിക്കൽ സെക്കണ്ടറി ഘടനകൾ എന്നിവ നിലവിലുണ്ടെന്ന് കണ്ടെത്തി (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം. 6d).ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നത് CT യുടെ ചില ഭാഗങ്ങൾ α-ഹെലിസുകളായി തുടരുമ്പോൾ മറ്റുള്ളവ β-ഷീറ്റുകളായി മാറുന്നു എന്നാണ്.അതിനാൽ, NMR സ്പെക്ട്രോസ്കോപ്പിയുടെ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത്, NT ഹൈഡ്രോജൽ രൂപീകരണത്തിന് പ്രധാനമാണെന്നും 2Rep, CT എന്നിവയുമായുള്ള സംയോജനത്തിൽ β-ഷീറ്റ് രൂപാന്തരീകരണത്തിലേക്ക് മാറുകയും ചെയ്യുന്നു.ഇതിന് അനുസൃതമായി, NT ഡൊമെയ്‌നിലെ അഞ്ച് ഹെലിസുകളിലും അമിലോയിഡ് സ്പേഷ്യൽ സിപ്പറുകൾ ഉണ്ടാകാൻ സാധ്യതയുണ്ടെന്ന് ഞങ്ങൾ അടുത്തിടെ കണ്ടെത്തി, വാൾട്ട്സ് അൽഗോരിതം ഹെലിക്‌സ് 1-ൽ ഒരു അമിലോയിഡോജെനിക് പ്രദേശം പ്രവചിച്ചു (ചിത്രം 4e).
2D സ്പെക്ട്ര 15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT ലായനിക്ക് മുമ്പും (നീല) 19 മണിക്കൂറിന് ശേഷവും (ചുവപ്പ്) 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ.ചുവന്ന സ്പെക്ട്രത്തിലെ വ്യക്തിഗത ക്രോസ് കൊടുമുടികളും നീല സ്പെക്ട്രത്തിലെ F24, G136, polyA എന്നിവ ഒറ്റ അക്ഷരത്തിലുള്ള അമിനോ ആസിഡ് ചിഹ്നങ്ങളും അവശിഷ്ട സംഖ്യകളും കൊണ്ട് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.NT, 2Rep, CT ഡൊമെയ്‌നുകളിൽ നിന്ന് തിരഞ്ഞെടുത്ത അവശിഷ്ടങ്ങൾക്കുള്ള സിഗ്നൽ തീവ്രതയുടെ ആശ്രിതത്വം ഇൻസെറ്റുകൾ കാണിക്കുന്നു.b His-NT2RepCT ഹൈഡ്രോജലുകളുടെ സോളിഡ്-സ്റ്റേറ്റ് റേഡിയോ ഫ്രീക്വൻസി (RFDR) സ്പെക്ട്ര.RFDR സ്പെക്ട്രയിൽ നിരീക്ഷിച്ച Cα/Cβ അവശിഷ്ടങ്ങളുടെ പരസ്പരബന്ധം, മോഡൽ പെപ്റ്റൈഡ് കെമിക്കൽ ഷിഫ്റ്റുകളുമായും സ്ഥിതിവിവരക്കണക്കുകളിൽ നിന്നും ഉരുത്തിരിഞ്ഞ മൂല്യങ്ങളുമായും അവയുടെ ദ്വിതീയ ഘടനകളുമായും താരതമ്യം ചെയ്താണ് നിർണ്ണയിക്കുന്നത്.SSB - കറങ്ങുന്ന സൈഡ്ബാൻഡ്.c 15N-HSQC 10 mg/mL NT ലായനിയുടെ വൺ-ഡൈമൻഷണൽ സ്പെക്ട്ര 36 മണിക്കൂർ 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ഇൻകുബേഷൻ സമയത്ത്.ഇൻസെറ്റ് വോള്യൂമെട്രിക് തീവ്രതയും സമയവും കാണിക്കുന്നു.d NT ഹൈഡ്രോജലുകളുടെ സോളിഡ് സ്റ്റേറ്റ് RFDR സ്പെക്ട്ര.RFDR സ്പെക്ട്രയിൽ നിരീക്ഷിച്ച Cα/Cβ അവശിഷ്ടങ്ങളുടെയും അവയുടെ ദ്വിതീയ ഘടനകളുടെയും പരസ്പരബന്ധം സൂചിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു.ഇ സിപ്പർ ഡാറ്റാബേസിൽ (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) നിന്നുള്ള NT45.79 ഫൈബ്രിലേഷൻ പ്രോപ്പൻസിറ്റി പ്രൊഫൈലിനെ അടിസ്ഥാനമാക്കി.ഹെക്സാപെപ്റ്റൈഡിന്റെ സ്പേഷ്യൽ മിന്നൽ ഷിഫ്റ്റ് വിൻഡോയുടെ റോസെറ്റ ഊർജ്ജം kcal/mol ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.ഉയർന്ന ഫൈബ്രോസിസ് പ്രവണതയുള്ള ഹെക്‌സാപെപ്‌റ്റൈഡുകളെ ചുവന്ന ബാറുകൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു (റോസെറ്റ എനർജി -23 കിലോ കലോറി/മോൾക്ക് താഴെ; ഡോട്ടഡ് ലൈനിന് താഴെ).ഗ്രീൻ ബാറുകൾ പരിധിക്ക് മുകളിലുള്ള റോസെറ്റ എനർജികളുള്ള ശകലങ്ങളെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു, അതിനാൽ സ്റ്റെറിക് സിപ്പറുകൾ ഉണ്ടാകാനുള്ള സാധ്യത കുറവാണ്.പ്രോലിൻ അടങ്ങിയ ശകലങ്ങൾ വിശകലനത്തിൽ നിന്ന് ഒഴിവാക്കി (നിരകളില്ലാതെ).വാൾട്സ് അൽഗോരിതം81 (https://waltz.switchlab.org) പ്രവചിച്ച അമിലോയിഡോസിസിന്റെ പ്രദേശങ്ങളെ ചതുരങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.NT യുടെ അമിനോ ആസിഡ് അവശിഷ്ടങ്ങളുടെ ക്രമം മുകളിലാണ്, കൂടാതെ β ദ്വിതീയ ഘടനയിൽ (സോളിഡ്-സ്റ്റേറ്റ് NMR സ്പെക്ട്രോസ്കോപ്പി നിർണ്ണയിക്കുന്നത്) കാണപ്പെടുന്ന അവശിഷ്ടങ്ങളുടെ തരങ്ങൾ ചുവപ്പിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.അഞ്ച് NT α-ഹെലിസുകളുടെ സ്ഥാനങ്ങൾ (H1-H5)28 ആയി നിശ്ചയിച്ചിരിക്കുന്നു.
pH <6.5-ൽ, HT ഡൈമറൈസ് ചെയ്യുന്നു, ചൂട്- അല്ലെങ്കിൽ യൂറിയ-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് ഡിനാറ്ററേഷനെ പ്രതിരോധിക്കും18.NT ഡൈമറൈസേഷനും സ്ഥിരതയും ജീലേഷനെ എങ്ങനെ ബാധിക്കുന്നുവെന്ന് വ്യക്തമാക്കുന്നതിന്, 100 mg/ml NT അടങ്ങിയ ലായനികൾ pH 8, 7, 6 എന്നിവയിൽ വിയൽ ഇൻവേർഷൻ ടെസ്റ്റ് ഉപയോഗിച്ച് നിയന്ത്രിച്ചു.NT സാമ്പിളുകൾ pH 8, 7 എന്നിവയിൽ 30 മിനിറ്റിന് ശേഷം 37 °C ൽ ജെൽ ചെയ്തു, എന്നാൽ pH 8 ജെൽ വ്യക്തമായിരുന്നു, അതേസമയം pH 7 ജെൽ ദൃശ്യമായ അവശിഷ്ടം കാണിച്ചു (ചിത്രം 5a).ഇതിനു വിപരീതമായി, pH 6-ൽ HT അടങ്ങിയ ഒരു ലായനി ഒരു ജെൽ രൂപപ്പെടുത്തിയില്ല, കൂടാതെ 20 മിനിറ്റിനു ശേഷം 37 ° C താപനിലയിൽ ഒരു വലിയ അവശിഷ്ടം കാണാനാകും.മോണോമറുകളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ ഡൈമറുകൾ സ്വയം കൂടാതെ/അല്ലെങ്കിൽ അവയുടെ ഉയർന്ന സ്ഥിരത ജിലേഷനെ തടയുന്നുവെന്ന് ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.200 mg/ml27-ൽ NT ലയിക്കുമെന്നും ചൂട് ഡീനാറ്ററേഷനുശേഷം എളുപ്പത്തിൽ റീഫോൾഡുചെയ്യുമെന്നും കുറഞ്ഞ മൂല്യങ്ങളിൽ α-ഹെലിക്സ് നിലനിർത്തുമെന്നും റിപ്പോർട്ടുചെയ്തതിനാൽ, pH 7, 6 എന്നിവയിൽ NT യുടെ ഒരു അവശിഷ്ടത്തിന്റെ രൂപീകരണം പ്രതീക്ഷിച്ചിരുന്നില്ല. pH 18. ഈ പൊരുത്തക്കേടുകൾക്കുള്ള ഒരു സാധ്യതയുള്ള വിശദീകരണം, മുമ്പ് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ട പരീക്ഷണങ്ങൾ മുറിയിലെ താപനിലയിലോ അതിനു താഴെയോ അല്ലെങ്കിൽ താരതമ്യേന കുറഞ്ഞ പ്രോട്ടീൻ സാന്ദ്രതയിലോ ആണ് നടത്തിയത് എന്നതാണ്.
37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ഇൻകുബേഷൻ കഴിഞ്ഞ് പിഎച്ച് 8, 7, 6, 154 എംഎം NaCl (pH 8) എന്നിവയിൽ NT വിയൽ ഇൻവേർഷൻ ടെസ്റ്റ് (100 mg/mL).യഥാക്രമം 154 mM NaF, 154 mM NaCl എന്നിവയുള്ളതും ഇല്ലാത്തതുമായ NT സിഡി സ്പെക്ട്ര.222 nm-ൽ മോളാർ ദീർഘവൃത്തം സ്വാഭാവിക മടക്കുകളുടെ അനുപാതത്തിലേക്ക് പരിവർത്തനം ചെയ്യപ്പെടുന്നു.c NT വിപരീത പരിശോധന (100 mg/mL) NT* (37 °C, 60 °C), NTA72R (37 °C), His-NT-L6 (37 °C, 60 °C).NT മ്യൂട്ടന്റുകളായ NT*, NTA72R, His-NT-L6 എന്നിവയുടെ d CD സ്പെക്ട്ര.222 nm-ൽ മോളാർ ദീർഘവൃത്തം സ്വാഭാവിക മടക്കുകളുടെ അനുപാതത്തിലേക്ക് പരിവർത്തനം ചെയ്യപ്പെടുന്നു.e NTFlSp, NTMiSp, കുറച്ച NTMiSp (100 mg/mL) എന്നിവയുടെ വിപരീത പരിശോധന.സ്കെയിൽ ബാർ 5 മി.മീ.NT, NTFlSp, NTMiSp, കുറച്ച NTMiSp എന്നിവയുടെ എഫ് സിഡി സ്പെക്ട്ര.222 nm-ൽ മോളാർ ദീർഘവൃത്തം സ്വാഭാവിക മടക്കുകളുടെ അനുപാതത്തിലേക്ക് പരിവർത്തനം ചെയ്യപ്പെടുന്നു.25 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിലും 95 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിലുമുള്ള പൂർണ്ണ NT സ്പെക്ട്ര സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 8 ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.
ഫിസിയോളജിക്കൽ ഉപ്പ് കോൺസൺട്രേഷൻ NT ഉപഘടകങ്ങൾ തമ്മിലുള്ള ഇലക്ട്രോസ്റ്റാറ്റിക് ഇടപെടലുകളും താഴ്ന്ന pH18 ലേക്ക് NT ട്രാൻസ്ഫർ ഡൈമറൈസേഷനും നിർണ്ണയിക്കുന്നു.154 mM NaCl, NaF എന്നിവയുടെ സാന്നിധ്യം യഥാക്രമം ജീലേഷനെ തടയുന്നുവെന്നും (ചിത്രം 5a, b; അനുബന്ധ ചിത്രം 2b) ഈ ലവണങ്ങൾ NT മോണോമറുകളുടെ താപ സ്ഥിരത വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നുവെന്നും ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (ചിത്രം. 5b, അനുബന്ധ ചിത്രം. 8) .ഡൈമറൈസേഷനുപകരം സ്ഥിരത വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നത് ജെൽ രൂപീകരണത്തെ തടയുന്നുവെന്നും ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
പ്രോട്ടീൻ ഡൈമറൈസേഷന്റെയും ജീലേഷനിലെ സ്ഥിരതയുടെയും പങ്ക് കൂടുതൽ പര്യവേക്ഷണം ചെയ്യാൻ, ഞങ്ങൾ രണ്ട് മ്യൂട്ടന്റുകൾ ഉപയോഗിച്ചു, NT*, NTA72R, അവയും കുറഞ്ഞ pH28.30-ൽ മോണോമെറിക് ആയി തുടരുന്നു.NT* ഒരു ഇരട്ട ചാർജ് റിവേഴ്‌സൽ മ്യൂട്ടന്റാണ്, അതിൽ മോണോമറിന്റെ പ്രത്യക്ഷമായ ദ്വിധ്രുവ ചാർജ് വിതരണം പരന്നതാണ്, ഇത് ഡൈമറൈസേഷൻ തടയുകയും മോണോമർ സ്ഥിരത ഗണ്യമായി വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.NTA72R ഒരു ചാർജ്ജ് ചെയ്ത ദ്വിധ്രുവമാണ്, എന്നാൽ Arg-സബ്സ്റ്റിറ്റ്യൂട്ടഡ് Ala സ്ഥിതി ചെയ്യുന്നത് ഡൈമർ അതിർത്തിയിലാണ്, അതിനാൽ മ്യൂട്ടേഷനുകൾ ഡൈമറൈസേഷന് ആവശ്യമായ ഉപയൂണിറ്റ് ഇടപെടലുകളെ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നു.37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ഇൻകുബേഷൻ ചെയ്യുമ്പോൾ, NT* ഒരു ഹൈഡ്രോജൽ രൂപപ്പെടുത്തിയില്ല, അതേസമയം NTA72R 15 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് അതാര്യമായ ജെൽ രൂപീകരിച്ചു (ചിത്രം 5c).NT*, NTA72R എന്നിവയ്‌ക്ക് ഡൈമറൈസ് ചെയ്യാൻ കഴിയില്ലെങ്കിലും മോണോമർ സ്ഥിരതയിൽ വ്യത്യാസമുണ്ട് (ചിത്രം 5d), ഉയർന്ന തെർമോഡൈനാമിക് സ്ഥിരത NT-യെ ജെല്ലിങ്ങിൽ നിന്ന് തടയുന്നുവെന്ന് ഈ ഫലങ്ങൾ ശക്തമായി സൂചിപ്പിക്കുന്നു.ഉയർന്ന ഊഷ്മാവിൽ (8 മിനിറ്റിന് ശേഷം 60 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ; ചിത്രം 5c) അസ്ഥിരമാകുമ്പോൾ HT* ഒരു ജെൽ രൂപപ്പെടുത്തുന്നു എന്ന വസ്തുതയും ഇത് പിന്തുണയ്ക്കുന്നു.NT-യിലെ ഉയർന്ന മെഥിയോണിന്റെ ഉള്ളടക്കം അതിന്റെ സ്വാഭാവിക മടക്കുകളെ ദ്രവീകരിക്കുന്നുവെന്നും ആറ് Met to Leu പകരമുള്ളവ (His-NT-L6 എന്ന് ഇവിടെ പരാമർശിക്കുന്നു) NT46 മോണോമറിനെ ശക്തമായി സ്ഥിരപ്പെടുത്തുന്നുവെന്നും മുമ്പ് തെളിയിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്.NT ജെൽ രൂപീകരണത്തിന് ഘടനാപരമായ വഴക്കം ആവശ്യമാണെന്ന അനുമാനത്തിന്റെ അടിസ്ഥാനത്തിൽ, His-NT-L6 സ്ഥിരതയുള്ള മ്യൂട്ടന്റ് 37 °C-ൽ ജെൽ ചെയ്തിട്ടില്ലെന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (ചിത്രം 5c, d).എന്നിരുന്നാലും, ഹിസ്-എൻടി-എൽ6 60 മിനിറ്റ് 60 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ഇൻകുബേഷനിൽ ഒരു ജെൽ രൂപീകരിച്ചു (ചിത്രം 5 സി).
β-ഷീറ്റ് ഘടനകളാക്കി രൂപാന്തരപ്പെടുത്താനും ഹൈഡ്രോജലുകൾ രൂപപ്പെടുത്താനുമുള്ള NT യുടെ കഴിവ് സ്പൈഡ്രോയിന്റെ എല്ലാ NT ഡൊമെയ്‌നുകൾക്കും ബാധകമല്ല.വ്യത്യസ്ത സിൽക്ക് തരങ്ങളിൽ നിന്നും ചിലന്തി സ്പീഷീസുകളിൽ നിന്നുമുള്ള NT-കൾ, ട്രൈക്കോനെഫില ക്ലാവിപ്സ് (NTFlSp), താരതമ്യേന കുറഞ്ഞ മെഥിയോണിൻ ഉള്ളടക്കവും ഉയർന്ന താപ സ്ഥിരതയും ഉണ്ടായിരുന്നിട്ടും ജെൽ രൂപീകരിച്ചു (ചിത്രം. 5e, f, സപ്ലിമെന്ററി ടേബിൾ 2).ഇതിനു വിപരീതമായി, കുറഞ്ഞ താപ സ്ഥിരതയും ഉയർന്ന മെഥിയോണിൻ ഉള്ളടക്കവുമുള്ള അരാനസ് വെൻട്രിക്കോസസിൽ നിന്നുള്ള (NTMiSp) ചെറിയ ആമ്പുള്ളർ പ്രോട്ടീൻ സ്പിഡ്രോയിനിൽ നിന്നുള്ള NT ഹൈഡ്രോജലുകൾ രൂപപ്പെടുത്തിയില്ല (അനുബന്ധ പട്ടിക 2, ചിത്രം 5e, f).രണ്ടാമത്തേത് ഇൻട്രാമോളിക്യുലർ ഡൈസൾഫൈഡ് ബോണ്ടുകളുടെ സാന്നിധ്യവുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കാം29,47.സ്ഥിരമായി, NTMiSp യുടെ ഡൈസൾഫൈഡ് ബോണ്ടുകൾ കുറയുമ്പോൾ, 10 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ഇൻകുബേഷൻ ചെയ്ത ശേഷം അത് ഒരു ഹൈഡ്രോജൽ രൂപീകരിച്ചു (ചിത്രം 5e).ഉപസംഹാരമായി, NT ൽ നിന്ന് ഒരു ജെൽ രൂപപ്പെടുന്നതിനുള്ള ഒരു പ്രധാന മാനദണ്ഡം ഘടനാപരമായ വഴക്കമാണ്, എന്നാൽ ഒരേയൊരു മാനദണ്ഡമല്ല എന്നത് ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്.പ്രസക്തമായേക്കാവുന്ന മറ്റൊരു ഘടകം അമിലോയിഡ് ഫൈബ്രിലുകൾ രൂപപ്പെടാനുള്ള പ്രവണതയാണ്, കൂടാതെ സിപ്പർ ഡാറ്റാബേസും വാൾട്ട്സ് അൽഗോരിതവും ഉപയോഗിച്ചുള്ള വിശകലനം ജെല്ലുകൾ രൂപപ്പെടുത്താനുള്ള കഴിവും അമിലോയിഡോജെനിക് പ്രദേശങ്ങളുടെ സാന്നിധ്യവും പ്രവചിച്ച പ്രദേശങ്ങളുടെ വ്യാപ്തിയും തമ്മിൽ ഒരു പരസ്പരബന്ധം കാണിച്ചു. സ്റ്റെറിക് സിപ്പറുകൾ രൂപീകരിക്കാൻ.ഒരു പരസ്പര ബന്ധമുണ്ടായിരുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ടേബിൾ 2, സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 9).
അനുകൂല സാഹചര്യങ്ങളിൽ ഫൈബ്രിലുകൾ രൂപീകരിക്കാനും ജെല്ലുകൾ രൂപപ്പെടുത്താനുമുള്ള NT യുടെ കഴിവ്, മറ്റ് പ്രോട്ടീൻ ശകലങ്ങളുമായുള്ള NT ഫ്യൂഷനുകൾക്ക് ഇപ്പോഴും ഫ്യൂഷൻ പങ്കാളികളുടെ പൂർണ്ണമായ പ്രവർത്തനത്തോടെ ജെല്ലുകൾ രൂപപ്പെടുത്താൻ കഴിയുമെന്ന് അനുമാനിക്കാൻ ഞങ്ങളെ പ്രേരിപ്പിച്ചു.ഇത് പരിശോധിക്കുന്നതിനായി, ഞങ്ങൾ യഥാക്രമം NT യുടെ C-ടെർമിനസിൽ ഗ്രീൻ ഫ്ലൂറസെന്റ് പ്രോട്ടീനും (GFP) പ്യൂരിൻ ന്യൂക്ലിയോസൈഡ് ഫോസ്ഫോറിലേസും (PNP) അവതരിപ്പിച്ചു.തത്ഫലമായുണ്ടാകുന്ന ഫ്യൂഷൻ പ്രോട്ടീനുകൾ E. coli ൽ വളരെ ഉയർന്ന അന്തിമ വിളവോടെ (150 mg/L, 256 mg/L ഷേക്ക് ഫ്ലാസ്ക് കൾച്ചറുകൾ യഥാക്രമം His-NT-GFP, His-NT-PNP എന്നിവയ്ക്ക്) കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. NT Ref-ലേക്ക് ലയിപ്പിച്ച മറ്റ് പ്രോട്ടീനുകൾക്ക്.30. His-NT-GFP (300mg/mL), His-NT-PNP (100mg/mL) ഫ്യൂഷൻ പ്രോട്ടീനുകൾ 2 മണിക്കൂറും 6.5 മണിക്കൂറും കഴിഞ്ഞ് 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ജെൽ രൂപീകരിച്ചു, പ്രധാനമായി, GFP ഫ്രാക്ഷൻ മാറ്റമില്ലാതെ തുടർന്നു.ജെലേഷനു ശേഷം നിരീക്ഷിക്കപ്പെടുന്നു, പ്രാരംഭ ഫ്ലൂറസെൻസ് തീവ്രതയുടെ 70% ജീലേഷനു ശേഷവും ശേഷിക്കുന്നു (ചിത്രം 6a).അവന്റെ-NT-PNP സൊല്യൂഷനുകളിലും ജെല്ലുകളിലും PNP പ്രവർത്തനം അളക്കാൻ, NT-യുമായി ഫ്യൂഷൻ പ്രോട്ടീൻ നേർപ്പിക്കേണ്ടി വന്നു, കാരണം ശുദ്ധമായ തയ്യാറെടുപ്പിന്റെ എൻസൈമാറ്റിക് പ്രവർത്തനം ജെല്ലിംഗ് കോൺസൺട്രേഷനിലെ പരിശോധനയുടെ കണ്ടെത്തൽ പരിധിക്ക് പുറത്തായിരുന്നു.0.01 mg/mL His-NT-PNP, 100 mg/mL NT എന്നിവ അടങ്ങിയ മിശ്രിതം ഉപയോഗിച്ച് രൂപപ്പെട്ട ജെൽ, പ്രിഇൻകുബേറ്റഡ് സാമ്പിളുകളുടെ പ്രാരംഭ എൻസൈമാറ്റിക് പ്രവർത്തനത്തിന്റെ 65% നിലനിർത്തി (ചിത്രം 6 ബി).അളക്കുന്ന സമയത്ത് ജെൽ കേടുകൂടാതെയിരിക്കും (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 10).
ഹിസ്-എൻടി-ജിഎഫ്‌പി (300 മില്ലിഗ്രാം/എംഎൽ) ജീലേഷന് മുമ്പും ശേഷവും ആപേക്ഷിക ഫ്ലൂറസെൻസ് തീവ്രത, ദൃശ്യവും അൾട്രാവയലറ്റ് ലൈറ്റിനും കീഴിൽ ഹിസ്-എൻടി-ജിഎഫ്‌പി ഹൈഡ്രോജൽ (300 മില്ലിഗ്രാം/എംഎൽ) അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന വിപരീത കുപ്പി.പോയിന്റുകൾ വ്യക്തിഗത അളവുകൾ കാണിക്കുന്നു (n = 3), പിശക് ബാറുകൾ സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷൻ കാണിക്കുന്നു.പിശക് ബാറുകളുടെ മധ്യഭാഗത്ത് ശരാശരി മൂല്യം കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.b PNP പ്രവർത്തനം NT (100 mg/ml), 0.01 mg/ml his-NT-PNP, 100 mg/ml ന്യൂ തായ്‌വാൻ ഡോളറുകൾ അടങ്ങിയ മിശ്രിതം എന്നിവ അടങ്ങിയ ലായനികളും ജെല്ലുകളും ഉപയോഗിച്ച് ഫ്ലൂറോമെട്രിക് വിശകലനം നടത്തി.ഹിസ്-എൻടി-പിഎൻപി (5 എംഎം സ്കെയിൽ ബാർ) അടങ്ങിയ ഹൈഡ്രോജൽ അടങ്ങിയ ഒരു വിപരീത കുപ്പി ഇൻസെറ്റ് കാണിക്കുന്നു.
ഇവിടെ, 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ പ്രോട്ടീൻ ലായനി ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തുകൊണ്ട് NT, മറ്റ് റീകോമ്പിനന്റ് സ്പൈഡ്രോയിൻ പ്രോട്ടീനുകളിൽ നിന്നുള്ള ഹൈഡ്രോജലുകളുടെ രൂപീകരണം ഞങ്ങൾ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുന്നു (ചിത്രം 1).α-ഹെലിസുകളെ β-ലെയറുകളാക്കി മാറ്റുന്നതും അമിലോയിഡ് പോലുള്ള ഫൈബ്രിലുകളുടെ രൂപീകരണവുമായി ജിലേഷൻ ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു (ചിത്രം 3 ഉം 4 ഉം).ഈ കണ്ടെത്തൽ ആശ്ചര്യകരമാണ്, കാരണം NT-കൾ വളരെ ഉയർന്ന സോളിബിലിറ്റിക്കും ഉയർന്ന സ്ഥിരതയ്ക്കും പേരുകേട്ട ഗോളാകൃതിയിലുള്ള ഫൈവ്-ഹെലിക്‌സ് ബണ്ടിലുകളാണ്.കൂടാതെ, µM-ൽ കുറഞ്ഞ പ്രോട്ടീൻ സാന്ദ്രതയിൽ ചൂട് ഡീനാറ്ററേഷനുശേഷം NT-കൾ പെട്ടെന്ന് വീണ്ടും വർധിക്കും.ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ അനുസരിച്ച്, ഫൈബ്രിൽ രൂപീകരണത്തിന്>10 mg/mL പ്രോട്ടീൻ സാന്ദ്രതയും ചെറുതായി ഉയർന്ന താപനിലയും (ചിത്രം 1) സംയോജിപ്പിക്കേണ്ടതുണ്ട്.ഫിസിയോളജിക്കൽ സാഹചര്യങ്ങളിൽ താപ ഏറ്റക്കുറച്ചിലുകൾ കാരണം ഭാഗികമായി ചുരുട്ടാത്ത അവസ്ഥയിലുള്ള ഗോളാകൃതിയിൽ മടക്കിയ പ്രോട്ടീനുകളിൽ നിന്ന് അമിലോയിഡ് ഫൈബ്രിലുകൾ രൂപപ്പെടുമെന്ന ആശയവുമായി ഇത് പൊരുത്തപ്പെടുന്നു.ഈ പരിവർത്തനത്തിന് വിധേയമാകുന്ന പ്രോട്ടീനുകളുടെ ഉദാഹരണങ്ങളിൽ ഇൻസുലിൻ 49,50, β2-മൈക്രോഗ്ലോബുലിൻ, ട്രാൻസ്തൈറെറ്റിൻ, ലൈസോസൈം51,52,53 എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു.NT അതിന്റെ മാതൃരാജ്യത്തിൽ α-ഹെലിക്സ് ആണെങ്കിലും, ഏകദേശം 65% പോളിപെപ്റ്റൈഡ് ശൃംഖല സ്റ്റെറിക് സിപ്പർ രൂപീകരണവുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു (ചിത്രം 4e) 45 .മോണോമർ ചലനാത്മകമായി മൊബൈൽ ആയതിനാൽ, മിതമായ ഉയർന്ന താപനിലയിൽ ഈ സാധ്യതയുള്ള അമിലോയിഡോജെനിക് പ്രദേശങ്ങളെ തുറന്നുകാട്ടാനും മൊത്തം പ്രോട്ടീന്റെ ഉയർന്ന സാന്ദ്രതയിൽ അമിലോയിഡ് ഫൈബ്രിൽ രൂപീകരണത്തിന് നിർണായകമായ സാന്ദ്രത കൈവരിക്കാനും കഴിയും.ഈ ന്യായവാദം പിന്തുടർന്ന്, സ്പിഡ്രോയിൻ സാന്ദ്രതയും ജീലേഷൻ സമയവും (ചിത്രം 1c) തമ്മിൽ ഒരു നെഗറ്റീവ് പരസ്പരബന്ധം ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി, കൂടാതെ മോണോമെറിക് NT കോൺഫോർമേഷൻ മ്യൂട്ടേഷനുകളിലൂടെയോ (NT*, His-NT-L6) അല്ലെങ്കിൽ ഉപ്പ് കൂട്ടിച്ചേർക്കലിലൂടെയോ സ്ഥിരത കൈവരിക്കുകയാണെങ്കിൽ, ഇത് തടയാൻ കഴിയും. രൂപീകരണം ഹൈഡ്രോജലുകൾ (ചിത്രം 5).
മിക്ക കേസുകളിലും, അമിലോയിഡ് ഫൈബ്രിലുകൾ ഒരു അവശിഷ്ടമായി ലായനിയിൽ നിന്ന് അപ്രത്യക്ഷമാകുന്നു, എന്നാൽ ചില വ്യവസ്ഥകളിൽ അവയ്ക്ക് ഹൈഡ്രോജലുകൾ 55,56,57 രൂപപ്പെടാം.ഹൈഡ്രോജൽ രൂപപ്പെടുന്ന ഫൈബ്രിലുകൾക്ക് സാധാരണയായി ഉയർന്ന വീക്ഷണാനുപാതം ഉണ്ടായിരിക്കുകയും തന്മാത്രാ എൻടാൻഗിൾമെന്റിലൂടെ സ്ഥിരതയുള്ള ത്രിമാന ശൃംഖലകൾ രൂപപ്പെടുത്തുകയും ചെയ്യുന്നു, 55,58 ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു.വിട്രോയിലെ ഹൈഡ്രോജൽ രൂപീകരണത്തിന്, പ്രോട്ടീനുകൾ പൂർണ്ണമായോ ഭാഗികമായോ വികസിക്കപ്പെടുന്നു, ഉദാഹരണത്തിന്, ജൈവ ലായകങ്ങൾ, ഉയർന്ന താപനില (70-90 ° C) കൂടാതെ/അല്ലെങ്കിൽ കുറഞ്ഞ pH (1.5-3.0) 59,60,61,62 എന്നിവയുമായി സമ്പർക്കം പുലർത്തുന്നതിലൂടെ.ഇവിടെ വിവരിച്ചിരിക്കുന്ന സ്പൈഡ്രോയിൻ ഹൈഡ്രോജലുകൾക്ക് കഠിനമായ പ്രോസസ്സിംഗ് ആവശ്യമില്ല, കൂടാതെ ഹൈഡ്രോജലുകളെ സ്ഥിരപ്പെടുത്തുന്നതിന് ക്രോസ്-ലിങ്കിംഗ് ഏജന്റുകൾ ആവശ്യമില്ല.
സിൽക്ക് സ്പിന്നിംഗ് സമയത്ത് β-ഷീറ്റ് സ്വിച്ചിംഗിന് വിധേയമാകുന്ന സ്പൈഡ്രോയിൻ ആവർത്തനങ്ങളും ക്യുഡികളും ഹൈഡ്രോജലുകൾ രൂപപ്പെടുന്നതായി മുമ്പ് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്.ഞങ്ങളുടെ കണ്ടെത്തലുകളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, ഇൻകുബേഷൻ സമയങ്ങളും കൂടാതെ/അല്ലെങ്കിൽ ഇൻകുബേഷൻ താപനിലയും യഥാക്രമം വളരെ കൂടുതലോ അതിലധികമോ ആയിരുന്നു, തത്ഫലമായുണ്ടാകുന്ന ഹൈഡ്രോജലുകൾ പലപ്പോഴും അതാര്യമായിരുന്നു (ചിത്രം 7, അനുബന്ധ പട്ടിക 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. ഫാസ്റ്റ് ജെൽ സമയത്തിന് പുറമേ, NT ഹൈഡ്രോജലുകൾ>300 mg/mL (30%) മറ്റെല്ലാ വിവരിച്ചിട്ടുള്ള റീകോമ്പിനന്റ് സ്പൈഡർ സിൽക്ക് പ്രോട്ടീൻ ഹൈഡ്രോജലുകളേയും കൂടാതെ ജെലാറ്റിൻ, ആൽജിനേറ്റ് (2%), അഗർ (0.5 %) പോലെയുള്ള പ്രകൃതിദത്ത ഹൈഡ്രോജലുകളെയും മറികടന്നു. ) കൂടാതെ കൊളാജൻ.(0.6%) (ചിത്രം 7, സപ്ലിമെന്ററി ടേബിളുകൾ 1, 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
ഈ പഠനത്തിലെ ഹൈഡ്രോജലുകളുടെ ജെൽ സമയവും ഇലാസ്റ്റിക് മോഡുലസും മറ്റ് സ്പിഡ്രോയിൻ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഹൈഡ്രോജലുകളുമായും തിരഞ്ഞെടുത്ത പ്രകൃതിദത്ത ഹൈഡ്രോജലുകളുമായും താരതമ്യം ചെയ്തു.ജെലേഷൻ അവസ്ഥകളുടെ വിവരണത്തോടൊപ്പം റഫറൻസുകളും നൽകിയിരിക്കുന്നു.എപിഎസ് അമോണിയം പെർസൾഫേറ്റ്, മുറിയിലെ താപനില.ഡാറ്റ 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
സ്‌പൈഡ്രോയിന് സ്‌റ്റോറേജ് സമയത്ത് ജെല്ലിംഗ് തടയാനുള്ള വഴികൾ ചിലന്തികൾ വികസിപ്പിച്ചതായി കാണുന്നു.സിൽക്ക് ഗ്രന്ഥിയിൽ പ്രോട്ടീന്റെ ഉയർന്ന സാന്ദ്രത ഉണ്ടായിരുന്നിട്ടും, ടെർമിനൽ ഡൊമെയ്‌നുമായി ബന്ധപ്പെട്ട വലിയ ആവർത്തന മേഖല അർത്ഥമാക്കുന്നത് ഗ്രന്ഥിയിലെ NT, CT എന്നിവയുടെ വ്യക്തമായ സാന്ദ്രത ഈ പഠനത്തിന്റെ അതിർത്തിയിൽ ഏകദേശം 10-20 mg/ml ന് തുല്യമാണ് എന്നാണ്.ഇൻ വിട്രോ നിരീക്ഷിച്ച ഹൈഡ്രോജൽ രൂപീകരണത്തിന് ആവശ്യമാണ്.കൂടാതെ, സിൽക്ക് ഗ്രന്ഥികളിൽ (ചിത്രം 5 ബി) പോലെ ലവണങ്ങളുടെ സമാനമായ സാന്ദ്രത 16 എൻടിയെ സ്ഥിരപ്പെടുത്തി.NT കൺഫർമേഷൻ E. coli സൈറ്റോസോളിൽ പഠിച്ചു, വിട്രോയിൽ പരിശോധിക്കുന്നതിനേക്കാൾ കൂടുതൽ ദൃഡമായി മടക്കിയതായി കണ്ടെത്തി, ഉപ്പോ മറ്റ് ഘടകങ്ങളോ വിവോയിൽ അതിന്റെ സംയോജനത്തെ തടയുന്നുവെന്ന് ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.എന്നിരുന്നാലും, NT-കൾ β-ഷീറ്റ് ഫൈബ്രിലുകളായി രൂപാന്തരപ്പെടാനുള്ള കഴിവ് ഫിലമെന്റ് രൂപീകരണത്തിന് പ്രധാനമായേക്കാം, ഭാവിയിലെ പഠനങ്ങളിൽ ഇത് അന്വേഷിക്കേണ്ടതാണ്.
ഈ പഠനത്തിൽ നിരീക്ഷിച്ച NT- അമിലോയിഡ് പോലുള്ള ഫൈബ്രിലിന്റെയും ഹൈഡ്രോജൽ രൂപീകരണത്തിന്റെയും പുതിയ വശങ്ങൾ കൂടാതെ, ഈ പ്രതിഭാസത്തിന് ബയോടെക്നോളജിക്കൽ, ബയോമെഡിക്കൽ ആപ്ലിക്കേഷനുകൾ ഉണ്ടായിരിക്കാമെന്നും ഞങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു (ചിത്രം 8).ആശയത്തിന്റെ തെളിവായി, ഞങ്ങൾ NT-യെ GFP അല്ലെങ്കിൽ PNP-യുമായി സംയോജിപ്പിച്ച്, 37 °C-ൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുമ്പോൾ ഫ്യൂഷൻ പ്രോട്ടീനും ഹൈഡ്രോജലുകളായി മാറുന്നുവെന്നും GFP, PNP ഭിന്നസംഖ്യകൾ അവയുടെ പ്രവർത്തനം കൂടുതലായി നിലനിർത്തുന്നുവെന്നും കാണിച്ചുതന്നു (ചിത്രം 6).ന്യൂക്ലിയോസൈഡ് ഫോസ്ഫോറിലേസുകൾ ന്യൂക്ലിയോസൈഡ് അനലോഗുകളുടെ പ്രധാന ഉൽപ്രേരകങ്ങളുടെ സമന്വയമാണ്, ഇത് ബയോഫാർമസ്യൂട്ടിക്കൽ വ്യവസായത്തിന് ഞങ്ങളുടെ കണ്ടെത്തലിനെ പ്രസക്തമാക്കുന്നു.അനുകൂല സാഹചര്യങ്ങളിൽ സുതാര്യമായ ഹൈഡ്രോജലുകൾ രൂപപ്പെടുന്ന ഫ്യൂഷൻ പ്രോട്ടീനുകൾ പ്രകടിപ്പിക്കുക എന്ന ആശയം, എൻസൈം ഇമ്മോബിലൈസേഷൻ, നിയന്ത്രിത ഡ്രഗ് റിലീസ്, ടിഷ്യു എഞ്ചിനീയറിംഗ് തുടങ്ങിയ വിപുലമായ ആപ്ലിക്കേഷനുകൾക്ക് അനുകൂലമായ ഗുണങ്ങളുള്ള പ്രവർത്തനക്ഷമമായ ഹൈഡ്രോജലുകൾ സൃഷ്ടിക്കാൻ അനുവദിക്കുന്നു.കൂടാതെ, NT, NT* എന്നിവ കാര്യക്ഷമമായ എക്സ്പ്രഷൻ മാർക്കറുകൾ 30 ആണ്, അതായത് ലയിക്കുന്ന ഫ്യൂഷൻ പ്രോട്ടീനുകളുടെ ഉയർന്ന ത്രൂപുട്ട് ഉൽപാദനത്തിനും 3D ഹൈഡ്രോജലുകളിൽ സ്ഥിരതയില്ലാത്ത ടാർഗെറ്റ് പ്രോട്ടീനുകൾ സൃഷ്ടിക്കുന്നതിനും NT-യും അതിന്റെ വകഭേദങ്ങളും ഉപയോഗിക്കാം.
NT ലയിക്കുന്നതും α-ഹെലിക്കലും കുറഞ്ഞ സാന്ദ്രതയിലും (µM) 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിലും സ്ഥിരതയുള്ളതുമാണ്.ഒരേ ഊഷ്മാവിൽ, എന്നാൽ വർദ്ധിച്ചുവരുന്ന സാന്ദ്രതയിൽ (>10 mg/ml), NT അമിലോയിഡ് പോലുള്ള ഫൈബ്രിലുകൾ അടങ്ങിയ ജെല്ലുകൾ ഉണ്ടാക്കുന്നു.NT ഫ്യൂഷൻ പ്രോട്ടീനുകൾ പൂർണ്ണമായി പ്രവർത്തനക്ഷമമായ ഫ്യൂഷൻ ശകലങ്ങളുള്ള ഫൈബ്രില്ലാർ ജെല്ലുകളും ഉണ്ടാക്കുന്നു, ഇത് NT ഉപയോഗിച്ച് 3D ഹൈഡ്രോജലുകളിൽ വിവിധ പ്രോട്ടീനുകളെ നിശ്ചലമാക്കാൻ അനുവദിക്കുന്നു.താഴെ: NT (PDB: 4FBS) കൂടാതെ ഫൈബർ നെറ്റ്‌വർക്കുകളുടെയും അനുബന്ധ പ്രോട്ടീൻ ഘടനകളുടെയും ചിത്രീകരണങ്ങളും (അനുമാനിക്കപ്പെടുന്നതും സ്കെയിലിലേക്ക് ആകർഷിക്കപ്പെടുന്നതും അല്ല, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.224RJ/pdpdbdbdb).
നിർമ്മിതികൾ (അമിനോ ആസിഡ് സീക്വൻസുകൾ ഉൾപ്പെടെയുള്ള പൂർണ്ണമായ പട്ടികയ്ക്കായി സപ്ലിമെന്ററി ടേബിൾ 4 കാണുക) പ്ലാസ്മിഡ് pT7 ആയി ക്ലോൺ ചെയ്യുകയും E. coli BL21 (DE3) ആയി രൂപാന്തരപ്പെടുകയും ചെയ്തു.എഞ്ചിനീയറിംഗ് പ്ലാസ്മിഡുകൾ അടങ്ങിയ E. coli കാനാമൈസിൻ (70 mg/l) ചേർത്ത് ലൂറിയ ചാറിൽ കുത്തിവയ്ക്കുകയും 30 ° C, 250 rpm എന്നിവയിൽ ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് വളർത്തുകയും ചെയ്തു.പിന്നീട് 1/100 കനാമൈസിൻ അടങ്ങിയ എൽബി മീഡിയത്തിലേക്ക് കൾച്ചർ കുത്തിവയ്ക്കുകയും OD600 0.8 ൽ എത്തുന്നതുവരെ 30 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിലും 110 ആർപിഎമ്മിലും സംസ്കരിക്കുകയും ചെയ്തു.എൻഎംആർ പഠനങ്ങൾക്കായി, ഐസോടോപ്പുകൾ ഉപയോഗിച്ച് പ്രോട്ടീൻ ലേബലിംഗിനായി 2 ഗ്രാം ഡി-ഗ്ലൂക്കോസ് 13 സി (ആൽഡ്രിച്ച്), 1 ഗ്രാം അമോണിയം ക്ലോറൈഡ് 15 എൻ (കേംബ്രിഡ്ജ് ഐസോടോപ്പ് ലബോറട്ടറീസ്, ഇൻക്.) എന്നിവ അടങ്ങിയ M9 മിനിമൽ മീഡിയത്തിലാണ് ബാക്ടീരിയകൾ വളർത്തിയത്.താപനില 20 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസായി താഴ്ത്തി, 0.15 എംഎം ഐസോപ്രോപൈൽത്തിയോഗലാക്റ്റോപൈറനോസൈഡ് (അവസാന സാന്ദ്രത) ഉപയോഗിച്ച് പ്രോട്ടീൻ എക്സ്പ്രഷൻ പ്രേരിപ്പിക്കുക.ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് പ്രോട്ടീൻ പ്രകടനത്തിന് ശേഷം, കോശങ്ങൾ 7278×g, 4 ° C 20 മിനിറ്റിൽ വിളവെടുത്തു.സെൽ പെല്ലറ്റുകൾ 20 mM Tris-HCl, pH 8-ൽ വീണ്ടും സസ്പെൻഡ് ചെയ്യുകയും കൂടുതൽ ഉപയോഗം വരെ ഫ്രീസുചെയ്യുകയും ചെയ്തു.30 kPa-യിൽ ഒരു സെൽ ഡിസ്‌റപ്റ്റർ (TS സീരീസ് മെഷീനുകൾ, കോൺസ്റ്റന്റ് സിസ്റ്റംസ് ലിമിറ്റഡ്, ഇംഗ്ലണ്ട്) ഉപയോഗിച്ച് ഉരുകിയ സെല്ലുകൾ ലൈസ് ചെയ്തു.തുടർന്ന് ലൈസെറ്റുകൾ 25,000 ഗ്രാം 30 മിനിറ്റ് 4 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്തു.NTMiSp-യ്‌ക്ക്, പെല്ലറ്റ് 2 M യൂറിയ, 20 mM Tris-HCl, pH 8 എന്നിവയിൽ വീണ്ടും സസ്പെൻഡ് ചെയ്യുകയും 2 മിനിറ്റ് (2 സെ ഓൺ/ഓഫ്, 65%) സോണിക്കേറ്റ് ചെയ്യുകയും, തുടർന്ന് 25,000 xg, 4 ° C. ഉള്ളിൽ വീണ്ടും സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു. 30 മിനിറ്റ്സൂപ്പർനാറ്റന്റ് ഒരു Ni-NTA കോളത്തിൽ കയറ്റി, 20 mM Tris-HCl, 2 mM ഇമിഡാസോൾ, pH 8 എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് കഴുകി, ഒടുവിൽ 20 mM Tris-HCl, 200 mM ഇമിഡാസോൾ, pH 8 എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് പ്രോട്ടീൻ എല്യൂട്ടുചെയ്‌തു. NT2RepCT സൃഷ്ടിക്കുന്നതിനും NTCT, thrombin digestion അവന്റെയും NT യുടെയും ഇടയിൽ സൈറ്റ് (ThrCleav) അവതരിപ്പിക്കുന്നു.His-NT-ThrCleav-2Rep (2Rep ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്നു), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (NT ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കുന്നു), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (സിടി ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്നു), His-Thioredoxin-ThrCleav-യിലും ത്രോംബിൻ ക്ലീവേജ് സൈറ്റുകൾ ഉണ്ട്. .* (എൻ‌ടി ഉൽ‌പാദിപ്പിക്കുന്നു*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (NTA72R ഉൽ‌പാദിപ്പിക്കുന്നു), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (NTF1Sp ഉൽ‌പാദിപ്പിക്കുന്നു), ഹിസ്-സൾഫർ റെഡോക്‌സിൻ-ThrCleav-NTMiSpdce (എൻ‌ടി‌എം‌എസ്‌പി‌ഡ്യൂസി).നിർമ്മിതികൾ ത്രോംബിൻ (1:1000) ഉപയോഗിച്ച് ദഹിപ്പിക്കുകയും 6-8 kDa തന്മാത്രാ ഭാരം ത്രെഷോൾഡുള്ള ഒരു സ്പെക്ട്ര/പോർ ഡയാലിസിസ് മെംബ്രൺ ഉപയോഗിച്ച് 20 mM Tris-HCl, pH 8 ഉപയോഗിച്ച് 4° C-ൽ ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് ഡയാലിസ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.ഡയാലിസിസിന് ശേഷം, ലായനി ഒരു Ni-NTA നിരയിലേക്ക് ലോഡുചെയ്യുകയും താൽപ്പര്യമുള്ള പ്രോട്ടീൻ അടങ്ങിയ മലിനജലം ശേഖരിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.നിർമ്മാതാവിന്റെ പ്രോട്ടോക്കോൾ അനുസരിച്ച് ബ്രാഡ്ഫോർഡ് വിശകലനം ഉപയോഗിച്ച NTF1Sp ഒഴികെ ഓരോ പ്രോട്ടീനിന്റെയും വംശനാശ ഗുണകം ഉപയോഗിച്ച് 280 nm-ൽ UV ആഗിരണം അളന്നുകൊണ്ടാണ് പ്രോട്ടീൻ സാന്ദ്രത നിർണ്ണയിക്കുന്നത്.എസ്ഡിഎസ് പോളിഅക്രിലാമൈഡ് (4-20%) ജെൽ ഇലക്‌ട്രോഫോറെസിസും കൂമാസി ബ്രില്ലിയന്റ് ബ്ലൂ സ്റ്റെയിനിംഗും ഉപയോഗിച്ചാണ് ശുദ്ധി നിർണ്ണയിക്കുന്നത്.20 മിനിറ്റ് സൈക്കിളുകളിൽ 10 kDa മോളിക്യുലാർ വെയ്റ്റ് കട്ട്ഓഫ് ഉപയോഗിച്ച് 4000 xg-ൽ സെൻട്രിഫ്യൂജ് ഫിൽട്ടറുകൾ (VivaSpin 20, GE Healthcare) ഉപയോഗിച്ച് പ്രോട്ടീനുകൾ കേന്ദ്രീകരിച്ചു.
പ്രോട്ടീൻ ലായനി ഉരുകുക, 150 µl 1 മില്ലി ക്ലിയർ സെപ്തം കുപ്പിയിലേക്ക് (8 x 40 mm തെർമോ സയന്റിഫിക്) ശ്രദ്ധാപൂർവ്വം പൈപ്പ് ചെയ്യുക.ബാഷ്പീകരണം തടയാൻ ട്യൂബുകൾ പാരാഫിലിം ഉപയോഗിച്ച് അടച്ച് അടച്ചു.സാമ്പിളുകൾ (n = 3) 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിലോ 60 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിലോ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും ജെലേഷൻ നിരീക്ഷിക്കാൻ ഇടയ്ക്കിടെ വിപരീതമാക്കുകയും ചെയ്തു.ജെൽ ചെയ്യാത്ത സാമ്പിളുകൾ ഒരാഴ്ചയെങ്കിലും ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു.10 μM പ്രോട്ടീനിൽ 10 mM DTT ഉള്ള NTMiSp ഡൈസൾഫൈഡ് ബോണ്ടുകൾ കുറയ്ക്കുക.പ്രകൃതിദത്ത സ്പൈഡർ സിൽക്ക് കോട്ടിംഗുകളുടെ ജീലേഷൻ വിശകലനം ചെയ്യാൻ, സ്വീഡിഷ് ബ്രിഡ്ജ് സ്പൈഡർ മുറിച്ചുമാറ്റി, രണ്ട് പ്രധാന ആമ്പൂൾ ചെയ്ത ഗ്രന്ഥികൾ 20 mM Tris-HCl ബഫർ pH 8-ൽ 200 μl സ്ഥാപിക്കുകയും പൂശിനെ ഗ്രന്ഥികളിൽ നിന്ന് വേർപെടുത്താൻ അനുവദിക്കുകയും ചെയ്തു..ഗ്രന്ഥികളിലെ ഉള്ളടക്കങ്ങൾ ബഫറിൽ ലയിക്കുന്നു, ഉണങ്ങിയ ഭാരം നിർണ്ണയിക്കാൻ 50 µl (ഓപ്പൺ കുപ്പികൾ ഇൻകുബേഷൻ വഴി 60 °C മുതൽ സ്ഥിരമായ ഭാരം വരെ), 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 150 µl.
അളക്കുന്ന ജ്യാമിതി/ഉപകരണം 20 മില്ലീമീറ്ററും 0.5 മില്ലീമീറ്ററും വ്യാസമുള്ള ഒരു സമാന്തര പ്ലേറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റെയിൻലെസ് സ്റ്റീൽ കൊണ്ടാണ് നിർമ്മിച്ചിരിക്കുന്നത്.സ്റ്റെയിൻലെസ് സ്റ്റീൽ അടിഭാഗം പെൽറ്റിയർ പ്ലേറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് സാമ്പിൾ 25 °C മുതൽ 45 °C വരെയും 25 °C വരെയും ചൂടാക്കുക.വൈബ്രേഷൻ അളവുകൾ യഥാക്രമം 100 mg/mL, 300-500 mg/mL എന്നിവയുടെ സാമ്പിളുകൾക്ക് 0.1 Hz ആവൃത്തിയിലും മെറ്റീരിയലിന്റെ ലീനിയർ വിസ്‌കോലാസ്റ്റിക് മേഖലയിലും 5%, 0.5% സമ്മർദ്ദം ചെലുത്തി.ബാഷ്പീകരണം തടയാൻ ഒരു ഇഷ്‌ടാനുസൃത ഹ്യുമിഡിറ്റി ചേമ്പർ ഉപയോഗിക്കുക.പ്രിസം 9 ഉപയോഗിച്ച് ഡാറ്റ വിശകലനം ചെയ്തു.
800 മുതൽ 3900 സെ.മീ–1 വരെയുള്ള ഊഷ്മാവിൽ ഇൻഫ്രാറെഡ് (IR) സ്പെക്ട്ര ശേഖരിക്കുന്നതിന്.എടിആർ ഉപകരണവും സ്പെക്ട്രോമീറ്ററിലൂടെയുള്ള ലൈറ്റ് പാതയും പരീക്ഷണത്തിന് മുമ്പും സമയത്തും ഉണങ്ങിയ ഫിൽട്ടർ ചെയ്ത വായു ഉപയോഗിച്ച് ശുദ്ധീകരിക്കപ്പെടുന്നു.പരിഹാരങ്ങൾ (500 മില്ലിഗ്രാം/എംഎൽ സ്പെക്ട്രയിലെ ജലാംശം കുറയ്ക്കാൻ) പരലുകളിലേക്ക് പൈപ്പ് ചെയ്തു, അളവെടുക്കുന്നതിന് മുമ്പ് ജെല്ലുകൾ (500 മില്ലിഗ്രാം/എംഎൽ) രൂപപ്പെടുകയും പിന്നീട് ക്രിസ്റ്റലുകളിലേക്ക് മാറ്റുകയും ചെയ്തു (n = 3).1000 സ്കാനുകൾ 2 cm-1 റെസല്യൂഷനോടും 2 ന്റെ സീറോ ഡ്യൂട്ടി സൈക്കിളോടും കൂടി രേഖപ്പെടുത്തി. രണ്ടാമത്തെ ഡെറിവേറ്റീവ് OPUS (Bruker) ഉപയോഗിച്ച് ഒമ്പത് പോയിന്റുകളുടെ സുഗമമായ ശ്രേണി ഉപയോഗിച്ച് കണക്കാക്കി.F. Menges "Spectragryph - Optical Spectroscopy Software" ഉപയോഗിച്ച് 1720 നും 1580 cm-1 നും ഇടയിൽ സ്പെക്ട്രയെ അതേ ഏകീകരണ മേഖലയിലേക്ക് നോർമലൈസ് ചെയ്തു.ATR-IR സ്പെക്ട്രോസ്കോപ്പിയിൽ, സാമ്പിളിലേക്ക് ഇൻഫ്രാറെഡ് ബീമിന്റെ തുളച്ചുകയറുന്ന ആഴം തരംഗനമ്പറിനെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു, ഇത് ഉയർന്ന തരംഗസംഖ്യകളേക്കാൾ താഴ്ന്ന തരംഗസംഖ്യകളിൽ ശക്തമായ ആഗിരണത്തിന് കാരണമാകുന്നു.ചിത്രത്തിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്ന സ്പെക്ട്രയ്ക്ക് ഈ ഇഫക്റ്റുകൾ തിരുത്തിയിട്ടില്ല.3 കാരണം അവ വളരെ ചെറുതാണ് (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 4).Bruker OPUS സോഫ്‌റ്റ്‌വെയർ ഉപയോഗിച്ചാണ് ഈ കണക്കിന്റെ ശരിയാക്കപ്പെട്ട സ്പെക്‌ട്ര കണക്കാക്കിയത്.
തത്വത്തിൽ, അമൈഡ് I പീക്കിനുള്ളിലെ ഘടകങ്ങളുടെ വിശ്വസനീയമായ ഡീകോൺവല്യൂഷനുശേഷം പ്രോട്ടീൻ അനുരൂപങ്ങളുടെ സമഗ്രമായ അളവ് സാധ്യമാണ്.എന്നിരുന്നാലും, പ്രായോഗികമായി ചില തടസ്സങ്ങൾ ഉണ്ടാകുന്നു.സ്പെക്ട്രത്തിലെ ശബ്ദം ഡീകോൺവല്യൂഷൻ സമയത്ത് (തെറ്റായ) കൊടുമുടികളായി ദൃശ്യമാകും.കൂടാതെ, വെള്ളം വളയുന്നത് മൂലമുള്ള കൊടുമുടി അമൈഡ് I കൊടുമുടിയുടെ സ്ഥാനവുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു, കൂടാതെ ഇവിടെ പഠിച്ച ജലീയ ജെൽ പോലുള്ള വലിയ അളവിൽ വെള്ളം അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന സാമ്പിളുകൾക്ക് സമാനമായ വ്യാപ്തി ഉണ്ടായിരിക്കാം.അതിനാൽ, ഞങ്ങൾ അമൈഡ് I പീക്ക് പൂർണ്ണമായും വിഘടിപ്പിക്കാൻ ശ്രമിച്ചില്ല, കൂടാതെ NMR സ്പെക്ട്രോസ്കോപ്പി പോലുള്ള മറ്റ് രീതികളെ പിന്തുണച്ചുകൊണ്ട് മാത്രമേ ഞങ്ങളുടെ നിരീക്ഷണങ്ങൾ പരിഗണിക്കാവൂ.
50 mg/ml NT, His-NT2RepCT എന്നിവയുടെ ലായനികൾ 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് ജെൽ ചെയ്തു.ഹൈഡ്രോജൽ 20 mM Tris-HCl (pH 8) ഉപയോഗിച്ച് 12.5 mg/m എന്ന സാന്ദ്രതയിലേക്ക് നേർപ്പിച്ച്, നന്നായി കുലുക്കി, ജെൽ തകർക്കാൻ പൈപ്പറ്റ് ചെയ്തു.അടുത്തതായി, ഹൈഡ്രോജൽ 20 mM Tris-HCl (pH 8) ഉപയോഗിച്ച് 10 തവണ ലയിപ്പിച്ചു, 5 μl സാമ്പിൾ ഫോംവാർ പൂശിയ ഒരു കോപ്പർ ഗ്രിഡിൽ പ്രയോഗിച്ചു, കൂടാതെ അധിക സാമ്പിൾ ബ്ലോട്ടിംഗ് പേപ്പർ ഉപയോഗിച്ച് നീക്കം ചെയ്തു.സാമ്പിളുകൾ 5 µl മില്ലിക്യു വെള്ളം ഉപയോഗിച്ച് രണ്ടുതവണ കഴുകി, 5 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 1% യുറേനൈൽ ഫോർമാറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റെയിൻ ചെയ്തു.ആഗിരണം ചെയ്യാവുന്ന പേപ്പർ ഉപയോഗിച്ച് അധിക കറ നീക്കം ചെയ്യുക, തുടർന്ന് മെഷ് വായുവിൽ ഉണക്കുക.100 കെവിയിൽ പ്രവർത്തിക്കുന്ന ഒരു FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN ഉപയോഗിച്ചാണ് ഈ ഗ്രിഡുകളിൽ ഇമേജിംഗ് നടത്തിയത്.ഒരു Veleta 2k × 2k CCD ക്യാമറ (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Germany) ഉപയോഗിച്ച് x 26,500, x 43,000 മാഗ്‌നിഫിക്കേഷനുകളിൽ ചിത്രങ്ങൾ റെക്കോർഡുചെയ്‌തു.ഓരോ സാമ്പിളിനും (n = 1), 10-15 ചിത്രങ്ങൾ രേഖപ്പെടുത്തി.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) ഇമേജ് വിശകലനത്തിനും ഫൈബർ വ്യാസം അളക്കുന്നതിനും ഉപയോഗിച്ചു (n = 100, വ്യത്യസ്ത നാരുകൾ).ജോടിയാക്കാത്ത ടി-ടെസ്റ്റുകൾ (ടു-ടെയിൽഡ്) നടത്താൻ പ്രിസം 9 ഉപയോഗിച്ചു.ശരാശരി His-NT2RepCT, NT fibrils എന്നിവ യഥാക്രമം 11.43 (SD 2.035), 7.67 (SD 1.389) nm ആയിരുന്നു.ആത്മവിശ്വാസ ഇടവേള (95%) -4.246 മുതൽ -3.275 വരെയാണ്.സ്വാതന്ത്ര്യത്തിന്റെ ഡിഗ്രി = 198, p <0.0001.
10 µM തയോഫ്ലേവിൻ ടി (ThT) അടങ്ങിയ 80 µl ലിക്വിഡ് സാമ്പിളുകൾ കോർണിംഗ് 96-വെൽ ബ്ലാക്ക് ബോട്ടം ക്ലിയർ താഴത്തെ പ്ലേറ്റുകൾ (കോർണിംഗ് ഗ്ലാസ് 3881, യുഎസ്എ) ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റാറ്റിക് അവസ്ഥയിൽ ത്രിപ്ലിക്കേറ്റിൽ (n = 3) അളന്നു.440 nm എക്‌സിറ്റേഷൻ ഫിൽട്ടറും 480 nm എമിഷൻ ഫിൽട്ടറും (ജർമ്മനിയിലെ ഒഫെൻബർഗിലെ BMG ലാബ്‌ടെക്കിൽ നിന്നുള്ള FLUOStar Galaxy) ഉപയോഗിച്ചാണ് ഫ്ലൂറസെൻസ് വ്യത്യാസങ്ങൾ രേഖപ്പെടുത്തിയത്.സിഗ്നൽ തീവ്രതയിൽ മാറ്റം വരുത്താതെ തന്നെ ThT യുടെ വ്യത്യസ്ത സാന്ദ്രതകളുള്ള പരീക്ഷണങ്ങൾ നടത്തിയതിനാൽ, ThT സിഗ്നൽ പൂരിതമോ ശമിപ്പിക്കുന്നതോ ആയിരുന്നില്ല.മൂടൽമഞ്ഞ് അളക്കുന്നതിന് 360 nm-ൽ റെക്കോർഡ് ആഗിരണം.വിത്തുപരീക്ഷണങ്ങൾക്കായി, 100 mg/mL gels 37° C.-ൽ രൂപീകരിച്ചു, പുനഃസ്ഥാപിച്ചു, 5%, 10%, 20% എന്നിവയുടെ മോളാർ അനുപാതത്തിൽ വിത്ത് വിതയ്ക്കാൻ ഉപയോഗിച്ചു.പ്രിസം 9 ഉപയോഗിച്ച് ഡാറ്റ വിശകലനം ചെയ്തു.
His-NT2RepCT, NT>100 mg/mL എന്നിവയുടെ സ്റ്റോക്കുകൾ ഐസിൽ ഉരുക്കി 0.22 µm ഫിൽട്ടറിലൂടെ ഫിൽട്ടർ ചെയ്യുക.നാനോഡ്രോപ്പ് ഉപയോഗിച്ച് 280 nm-ൽ ആഗിരണം ചെയ്താണ് സാന്ദ്രത കണക്കാക്കുന്നത്.വ്യക്തമായ അടിഭാഗമുള്ള 96-കിണർ കറുത്ത നോൺ-ബൈൻഡിംഗ് പ്ലേറ്റിന്റെ (കോർണിംഗ്) കിണറുകളിൽ, സാമ്പിളുകൾ 20 mM Tris-HCl pH 8-ൽ 20 mg/ml ആയി ലയിപ്പിച്ച് 5 μM ThT (അവസാന സാന്ദ്രത), മൊത്തം സാമ്പിൾ സാന്ദ്രത 50 μl വോളിയം.സംപ്രേഷണം ചെയ്ത ലൈറ്റ് ചാനലും എഫ്‌ഐടിസി എക്‌സിറ്റേഷനും ടിഎച്ച്ടി ഇമേജിംഗിനായി എമിഷൻ ഫിൽട്ടർ സെറ്റുകളും ഉപയോഗിച്ച് സെൽഓബ്‌സെർവർ (സെയ്‌സ്) മൈക്രോസ്കോപ്പിൽ 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ഓരോ 10 മിനിറ്റിലും സാമ്പിളുകൾ ചിത്രീകരിച്ചു.ഇമേജിംഗിനായി 20x/0.4 ലെൻസാണ് ഉപയോഗിക്കുന്നത്.സെൻ ബ്ലൂ (Zeiss), ImageJ (https://imagej.nih.gov/) എന്നിവ ഇമേജ് വിശകലനത്തിനായി ഉപയോഗിച്ചു.20 mM Tris pH 8 ഉം 5 µM ThT ഉം അടങ്ങിയ 50 mg/mL സാന്ദ്രതയിൽ NT, His-NT2RepCT ലായനികളിൽ നിന്നും ജെല്ലുകൾ തയ്യാറാക്കി 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 90 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു.20 mM Tris, pH 8, 5 μM ThT എന്നിവ അടങ്ങിയ ഒരു പുതിയ കിണറ്റിലേക്ക് ജെൽ കഷണങ്ങൾ മാറ്റി, ഒരു നോൺ-ബൈൻഡിംഗ് ബ്ലാക്ക് 96 നന്നായി വ്യക്തമായ അടിത്തട്ടിൽ.20x/0.4 മാഗ്‌നിഫിക്കേഷനിൽ പച്ച ഫ്ലൂറസെൻസും ബ്രൈറ്റ് ഫീൽഡ് ഇമേജുകളും നേടുക.ഇമേജ് വിശകലനത്തിനായി ഇമേജ് ജെ ഉപയോഗിച്ചു.
ക്യുസിഐ ക്വാഡ്രുപോൾ റെസൊണൻസ് പൾസ്ഡ് ഗ്രേഡിയന്റ് ഫീൽഡ് ക്രയോപ്രോബ് (എച്ച്എഫ്‌സിഎൻ) ഘടിപ്പിച്ച 600 മെഗാഹെർട്സ് ബ്രൂക്കർ അവൻസ് നിയോ സ്പെക്ട്രോമീറ്ററിൽ സൊല്യൂഷൻ എൻഎംആർ സ്പെക്ട്ര 310 കെയിൽ ലഭിച്ചു.20 mM Tris-HCl (pH 8), 0.02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) എന്നിവയിൽ 13C, 15N എന്ന് ലേബൽ ചെയ്‌ത 10 mg/mL ഹോമോജീനിയസ് പ്രോട്ടീൻ അടങ്ങിയ NMR സാമ്പിളുകൾ .15N-HSQC യുടെ 2D സ്പെക്‌ട്രത്തിൽ പീക്ക് 23 അസൈൻ ചെയ്യാൻ pH 6.7-ലെ NT2RepCT-ന്റെ കെമിക്കൽ ഷിഫ്റ്റുകൾ ഉപയോഗിച്ചു.
മാജിക് ആംഗിൾ സ്പിന്നിംഗ് സോളിഡ് NMR (MAS) സ്പെക്ട്ര 13C, 15N-ലേബൽ ചെയ്ത ഹൈഡ്രോജലുകൾ 3.2 mm 13C/15N{1H} ഇലക്ട്രോൺലെസ് പ്രോബ് സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്ന 800 MHz-ൽ ബ്രൂക്കർ അവൻസ് III HD സ്പെക്ട്രോമീറ്ററിൽ രേഖപ്പെടുത്തി.277 കെയിൽ വേരിയബിൾ ടെമ്പറേച്ചർ ഗ്യാസ് സ്ട്രീം ഉപയോഗിച്ച് സാമ്പിൾ താപനില നിയന്ത്രിച്ചു. 12.5 kHz, 20 kHz എന്നീ MAS ആവൃത്തികളിൽ ദ്വിമാന ദ്വിമാന ഭ്രമണ അനുരണനം (DARR)76, റേഡിയോ ഫ്രീക്വൻസി റീകണക്ഷൻ (RFDR)77 സ്പെക്ട്ര എന്നിവ യഥാക്രമം നേടിയെടുത്തു.1H മുതൽ 13C വരെയുള്ള ക്രോസ് പോളറൈസേഷൻ (CP) 60.0 മുതൽ 48.0 kHz വരെയുള്ള ലീനിയർ റാംപ് ഉപയോഗിച്ച് 1H, 61.3/71.6 kHz 13C (12.5/20 kHz MAS-ൽ), കോൺടാക്റ്റ് സമയം 0.5-1 ms.വിവരശേഖരണ വേളയിൽ 73.5 kHz-ൽ Spinal6478 decoupling ഉപയോഗിച്ചു.ഏറ്റെടുക്കൽ സമയം 10 ​​മില്ലിസെക്കൻഡും സൈക്കിൾ കാലതാമസം 2.5 സെക്കൻഡും ആയിരുന്നു.RFDR സ്പെക്ട്രയിൽ നിരീക്ഷിച്ച സിംഗിൾ-ലിങ്ക്ഡ് Cα/Cβ കോറിലേഷനുകൾ DARR സ്പെക്ട്രയിലെ സ്വഭാവ സവിശേഷതകളായ അവശിഷ്ട-തരം കെമിക്കൽ ഷിഫ്റ്റുകളും ഗുണിത-ലിങ്ക്ഡ് കോറിലേഷനുകളും അടിസ്ഥാനമാക്കിയാണ് നൽകിയിരിക്കുന്നത്.
Zipper79 ഡാറ്റാബേസ് (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) NT, NTFlSp, NTMiSp എന്നിവയ്‌ക്കായുള്ള ഫ്ലട്ടർ പ്രവണതകളും റോസെറ്റ എനർജിയും വിലയിരുത്താൻ ഉപയോഗിച്ചു.സിപ്പർ ഡാറ്റാബേസ് റോസെറ്റ എനർജി80 കണക്കാക്കുന്നു, ഇത് പ്രോട്ടീൻ ഘടനയെ മാതൃകയാക്കാനും വിശകലനം ചെയ്യാനും നിരവധി സ്വതന്ത്ര ഊർജ്ജ പ്രവർത്തനങ്ങൾ സംയോജിപ്പിക്കുന്നു.-23 കിലോ കലോറി/മോൾ അല്ലെങ്കിൽ അതിൽ താഴെയുള്ള ഊർജ്ജ നില ഫൈബ്രിലേറ്റിനുള്ള ഉയർന്ന പ്രവണതയെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.താഴ്ന്ന ഊർജ്ജം അർത്ഥമാക്കുന്നത് സിപ്പർ കോൺഫോർമേഷനിലെ രണ്ട് β-സ്ട്രോണ്ടുകളുടെ കൂടുതൽ സ്ഥിരതയാണ്.കൂടാതെ, NT, NTFlSp, NTMiSp എന്നിവയിലെ അമിലോയിഡോജെനിക് പ്രദേശങ്ങൾ പ്രവചിക്കാൻ വാൾട്ട്സ് അൽഗോരിതം ഉപയോഗിച്ചു.81. (https://waltz.switchlab.org/).
NT പ്രോട്ടീൻ ലായനി 2-(N-morpholino) എത്തനെസൽഫോണിക് ആസിഡ് (MES) ബഫറുമായി pH 5.5, 6.0 എന്നിവയിൽ കലർത്തി, pH യഥാക്രമം pH 6, 7 ആയി കുറയ്ക്കുന്നു.അവസാന പ്രോട്ടീൻ സാന്ദ്രത 100 മില്ലിഗ്രാം / മില്ലി ആണ്.
J-1500 CD സ്പെക്ട്രോമീറ്ററിൽ (JASCO, USA) 0.1 സെന്റീമീറ്റർ ഒപ്റ്റിക്കൽ പാത്ത് ഉപയോഗിച്ച് 300 μL ക്യൂവെറ്റ് ഉപയോഗിച്ച് അളവുകൾ നടത്തി.20 mM ഫോസ്ഫേറ്റ് ബഫറിൽ (pH 8) പ്രോട്ടീനുകൾ 10 μM (n = 1) ആയി ലയിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു.ഉപ്പിന്റെ സാന്നിധ്യത്തിൽ പ്രോട്ടീൻ സ്ഥിരത വിശകലനം ചെയ്യാൻ, യഥാക്രമം 154 mM NaF അല്ലെങ്കിൽ NaCl അടങ്ങിയ 20 mM ഫോസ്ഫേറ്റ് ബഫറിൽ (pH 8) ഒരേ സാന്ദ്രതയിൽ (n = 1) പ്രോട്ടീനുകൾ വിശകലനം ചെയ്തു.താപനില സ്കാനുകൾ 25 ° C മുതൽ 95 ° C വരെ 222 nm-ൽ 1 ° C / മിനിറ്റ് ചൂടാക്കൽ നിരക്ക് രേഖപ്പെടുത്തി.നേറ്റീവ് ഫോൾഡഡ് പ്രോട്ടീനുകളുടെ അനുപാതം (KDmeasure - KDfinal)/(KDstart - KDfinal) എന്ന ഫോർമുല ഉപയോഗിച്ചാണ് കണക്കാക്കിയത്.കൂടാതെ, ഓരോ സാമ്പിളിനും 260 nm മുതൽ 190 nm വരെ 25 ° C ലും 95 ° C വരെ ചൂടാക്കിയതിനും ശേഷം അഞ്ച് സ്പെക്ട്രകൾ രേഖപ്പെടുത്തി.അഞ്ച് സ്പെക്ട്രകൾ ശരാശരി, മിനുസപ്പെടുത്തുകയും മോളാർ എലിപ്റ്റിസിറ്റിയിലേക്ക് പരിവർത്തനം ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.പ്രിസം 9 ഉപയോഗിച്ച് ഡാറ്റ വിശകലനം ചെയ്തു.
ഹിസ്-എൻടി-ജിഎഫ്പിയുടെ (300 mg/mL, 80 µL) ഫ്ലൂറസെൻസ് തീവ്രത 96-കിണർ കോർണിംഗ് പ്ലേറ്റുകളിൽ കറുത്ത സുതാര്യമായ അടിവശം (കോർണിംഗ് ഗ്ലാസ് 3881, യുഎസ്എ) ഉള്ള അവസ്ഥയിൽ മൂന്ന് തവണയായി (n = 3) അളന്നു.395 nm ഉത്തേജന തരംഗദൈർഘ്യമുള്ള ഫ്ലൂറസെൻസ് അധിഷ്ഠിത പ്ലേറ്റ് റീഡർ ഉപയോഗിച്ച് സാമ്പിളുകൾ അളക്കുക, കൂടാതെ 509 nm ലും ജിലേഷന് മുമ്പും 2 മണിക്കൂർ കഴിഞ്ഞ് 37 ° C ലും ഉദ്‌വമനം രേഖപ്പെടുത്തുക.പ്രിസം 9 ഉപയോഗിച്ച് ഡാറ്റ വിശകലനം ചെയ്തു.
നിർമ്മാതാവിന്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾ അനുസരിച്ച് പ്യൂരിൻ ന്യൂക്ലിയോസൈഡ് ഫോസ്ഫോറിലേസ് ആക്റ്റിവിറ്റി അസ്സെ കിറ്റ് (ഫ്ലൂറോമെട്രിക് രീതി, സിഗ്മ ആൽഡ്രിച്ച്) ഉപയോഗിച്ചു.His-NT-PNP അടങ്ങിയ ജെല്ലുകളിലെയും ലായനികളിലെയും പ്രവർത്തനം അളക്കാൻ, 10 ​​ng His-NT-PNP 100 mg/mL NT യുമായി 2 µL ന്റെ മൊത്തം വോള്യത്തിൽ കലർത്തുക, കാരണം ജെൽ സെറ്റിന്റെ കണ്ടെത്തൽ ഇടവേളയ്ക്ക് മുകളിൽ ഒരു സിഗ്നൽ നൽകി.ഹിസ്-എൻടി-പിഎൻപി ഇല്ലാത്ത ജെല്ലുകളുടെയും പരിഹാരങ്ങളുടെയും നിയന്ത്രണങ്ങൾ ഉൾപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട്.അളവുകൾ രണ്ടുതവണ നടത്തി (n = 2).പ്രവർത്തനം അളന്നതിന് ശേഷം, പ്രതികരണ മിശ്രിതം നീക്കം ചെയ്യുകയും അളക്കുന്ന സമയത്ത് ജെൽ കേടുകൂടാതെയുണ്ടെന്ന് ഉറപ്പാക്കാൻ ജെൽ ഫോട്ടോയെടുക്കുകയും ചെയ്തു.പ്രിസം 9 ഉപയോഗിച്ച് ഡാറ്റ വിശകലനം ചെയ്തു.
പഠന രൂപകല്പനയെക്കുറിച്ചുള്ള കൂടുതൽ വിവരങ്ങൾക്ക്, ഈ ലേഖനവുമായി ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്ന പ്രകൃതി പഠന സംഗ്രഹം കാണുക.
ചിത്രം 1 ഉം 2 ഉം പ്രാരംഭ ഡാറ്റ അവതരിപ്പിക്കുന്നു.1c, 2a-c, 3a, b, e-g, 4, 5b, d, f, and 6, അനുബന്ധ ചിത്രം.3, അനുബന്ധ അത്തിപ്പഴം.5a, d, സപ്ലിമെന്ററി അത്തിപ്പഴം.6 കൂടാതെ സപ്ലിമെന്ററി അത്തിപ്പഴം.8. ഈ പഠനത്തിൽ നിന്നുള്ള ഡാറ്റ സെനോഡോ ഡാറ്റാബേസിൽ ഹോസ്റ്റ് ചെയ്തിരിക്കുന്നു https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.ഈ പഠനത്തിൽ ലഭിച്ച NMR ഡാറ്റ എൻട്രി ഐഡി bmrbig36-ന് കീഴിലുള്ള BMRBig റിപ്പോസിറ്ററിയിൽ പോസ്റ്റ് ചെയ്തിട്ടുണ്ട്.GFP, PNP എന്നിവയുടെ ഘടനകൾ PDB-ൽ നിന്ന് എടുത്തതാണ് (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
റൈസിംഗ്, എ., ജോഹാൻസൺ, ജെ. സ്പിന്നിംഗ് കൃത്രിമ ചിലന്തി സിൽക്ക്.ദേശീയ കെമിക്കൽ.ജീവശാസ്ത്രം.11, 309–315 (2015).
ബാബ്, PL et al.Nephila clavipes ജീനോം സ്പൈഡർ സിൽക്ക് ജീനുകളുടെ വൈവിധ്യവും അവയുടെ സങ്കീർണ്ണമായ ആവിഷ്കാരവും എടുത്തുകാണിക്കുന്നു.ദേശീയ ജനെറ്റ്.49, 895–903 (2017).